植物CPP基因家族的分子進化研究

實驗概要

類CPP基因家族(CPP-like gene family)屬于一類成員數目較少的基因家族，該基因家族成員編碼的蛋白質序列含有一到兩個富含半耽氨酸的結構域，即CXC結構域。該基因家族在植物和動物中廣泛存在，但是沒有在酵母中發現。為了解CPP-like基因家族在植物中的進化規律，本研究對擬南芥和水稻基因組中的CPP-like基因家族進行了比較分析和分子進化研究。

實驗步驟

1. 序列搜索

在NCBI數據庫中獲得擬南芥的TSO1和大豆的CPP1基因編碼的蛋白質序列，并以這兩段蛋白質序列為檢索序列，通過BLASTP檢索TIGR擬南芥基因組注釋數據庫(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/athl/)和TIGR水稻基因組注釋數據庫(http://rice.tigr.org/tdb/e2k1/osal/index.shtml)。若檢索出的蛋白質序列滿足E≤10^-l0，將被作為候選蛋白序列。然后利用Pfam工具檢測候選序列中是否存在CXC結構域，若存在CXC結構域，則將其作為CPP-like基因編碼的蛋白質序列。最后在利用新檢索出的擬南芥和水稻的CPP-like蛋白質序列重新對上述數據庫進行重新檢索，直到沒有新的序列檢出為止。本研究中涉及的CPP-like基因的核昔酸序列，編碼序列和編碼的蛋白質序列均來自于TIGR數據庫。此外本研究還利用TBLASTN和BLASTP分別檢索了NCBI和Swiss-Prot數據庫，以獲得其他植物物種中已知的CPP-like基因。

2. 多序列聯配和系統發生樹的構建

對植物基因組中CPP-like蛋白質序列的多序列聯配采用的是CLUSTAL W軟件，參數為默認。將多序列的結果輸出到MEGA 4軟件中，并利用MEGA構建系統發生樹，方法為鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)，參數為P距離模型(p-distancemodel)和空位/缺失數據的成對刪除模式(pairwise deletion of gaps/missing data)，并利用bootstrapping方法對樹進行評估。系統發生樹的展示同樣利用MEGA 4。

3. 基因擴張模式的分析

植物基因組中最重要的兩種基因擴張模式為串聯重復和片段復制。串聯重復指的是同一家族的基因出現在染色體的同一區段或相鄰區段。而片段重復則通常表現為一大片段區域中所有基因的重復，而不是單個基因或少量幾個基因的重復。本研究中利用Gramme對基因組注釋的結果將獲得的CPP-like基因定位在染色體上。首先確定若在同一區段出現的CPP-like基因則被認為是通過串聯重復形成的。對片段重復方式的研究，首先通過TIGR對擬南芥和水稻基因組的注釋，找到每一CPP-like基因上游和下游各10編碼基因的蛋白質序列，然后利用本地BLASTP軟件分析是否在一對CPP-like基因的兩側還存在其它的旁系同源基因對，若存在其它的旁系同源基因對，則表明這對CPP-like基因起源于一次片段重復事件。

4. 正選擇作用分析

核苷酸的非同義替換率(d_N)和同義替換率(d_S)的比值(d_N/d_S)是衡量選擇壓力的分子進化參數，通常用ω表示。ω>1表示正選擇壓力(positive selection)；ω<1表示純化選擇壓力(purifying selection)；而ω=1表示中性選擇或自然選擇壓力(neutral selection)。正選擇作用的分析采用的是極大似然方法來確定具有正選擇作用的系統發生樹節點以及這些節點包含基因的多序列聯配中經歷正選擇作用的氨基酸位點。由于這些方法的適用條件是至少包含三段同源序列，所以本研究分析了系統發生樹中包含三個以上基因的節點。首先對每一待分析的節點中包含的蛋白質序列進行了多序列聯配，然后利用PAL2NAL軟件將蛋白質的多序列聯配結果轉換為編碼序列的多序列聯配，并去除多序列聯配中產生的空位(gap)。將編碼序列的多序列聯配結果再導入到PAML4軟件的CODEML程序中，并利用該程序計算相應的d_N/d_S(ω)，即非同義替換率與同義替換率的比值。根據系統樹和序列對位排列結果，采用“位點特異性”模型(site-specific model)下的各種密碼子替換模型來計算每個位點上的ω。似然比測驗(LRT)可以用于比較嵌套間差異的顯著性，前提是似然比的比較結果基本遵循卡方分布，其自由度為兩個模型間自由參數之差。在本研究中采用M3(離散模型)對M0(單個ω)模型檢驗位點間是否存在選擇壓力的差異；并用M8對M7模型檢驗正選擇壓力。M7和M8模型均采用離散刀分布來估計每個位點的ω值，并通過參數p和q來描述刀分布，M8和M7的不同之處在于M8添加了一類ω>1的位點，可用于檢驗正選擇。若M8對M7的統計檢驗達到顯著水平，并且M8模型具有ω>1，再通過貝葉斯方法估計經歷正選擇作用的位點。

5. 結構域的協同進化分析

大部分植物的CPP-like基因編碼的蛋白質序列中包含兩個CXC結構域，而且結構域序列及兩段結構域之間的序列均是高度保守的，因此本研究認為兩段CXC結構域在進化過程中很可能是協同進化的。本研究對CXC結構域的協同進化現象進行了研究。分析中，包含兩段CXC結構域序列的蛋白質被分成5個部分，分別為N-末端序列、CXC結構域1、結構域之間的序列、CXC結構域2和C-末端序列。由于N-末端序列和C-末端序列的保守性較差，所以在本研究中重點考慮了CXC結構域1、結構域之間序列和CXC結構域2之間的協同進化現象。首先分別將這三段序列進行多序列聯配，并利用MEGA 4來計算兩兩之間的進化距離。獲得進化距離之后，再求取三段序列進化距離之間的相關系數(r)。顯著高于0的相關系數被認為是正向的協同進化，顯著小于0的相關系數被認為是負向的協同進化，而若與0表現出沒有顯著差異，則認為不存在協同進化現象。

對計算所得的相關系數采用兩種方法進行了統計顯著性檢驗，首先對相關系數：按照bootstrapping的方法進行了1000次重抽樣，其次通過隨機的方式對進化距離矩陣進行了1000次重抽樣，并進而獲得1000個隨機的相關系數，以此來估計真實相關系數的概率(p)。以上的模擬工作是在Matlab軟件中完成的。