植酸酶的酶學性質研究

植酸酶是催化植酸及其鹽類水解成肌醇和磷酸的一類酶的總稱[1]。添加植酸酶能夠顯著提高植物性飼料中磷的利用率，減少飼料中無機磷的添加量以及動物糞便中無機磷的排出，降低植酸磷的抗營養作用，促進動物生長發育，減輕環境的磷污染，提高畜牧生產和生態效益[2]。
隨著飼料工業的發展,植酸酶作為一種新型的飼料添加劑已廣泛用于飼料加工中,近年來,人們越來越關注養殖業中排放磷對環境的污染。由于酸性植酸酶酶促反應的pH值有效作用范圍在2.5～5.5,所以它僅適用于胃pH值呈酸性的單胃畜禽動物及少數魚類(如虹鱒)等,不適用于消化道為中性的鯉科魚類和禽畜消化道中呈中性的部位[3]。本文以中性植酸酶為研究對象,研究了其最適反應溫度、最適反應pH值、pH值的穩定性、耐熱性、底物濃度以及該酶的米氏常數和最大反應速度，并對酶的檢測條件做了相應分析，為中性植酸酶的應用和生產提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
中性植酸酶由武漢新華揚生物股份有限公司生產。
試劑為植酸鈉、鉬酸銨、釩酸銨、無水乙酸鈉、牛血清白蛋白、磷酸二氫鉀。
1.2 主要實驗儀器
紫外可見分光光度計、電子分析天平、可調恒溫水浴鍋、精密pH計等。
1.3 酶活力測定
采用《飼用中性植酸酶活性的測定——分光光度法》所規定的方法(新華揚企業標準)測定酶活力。
1.4 實驗方法
1.4.1 檢測條件的分析
1.4.1.1 標準曲線的線性范圍
采用釩鉬酸銨法（見1.3）。準確稱取0.680 4 g在105 ℃烘至恒重的基準磷酸二氫鉀于100 ml容量瓶中,用乙酸緩沖液溶解,并定容至刻度,濃度為50.0 mmol/l。用乙酸緩沖液稀釋成不同的濃度，與待測試樣一起反應測定。以吸光值為橫坐標，無機磷的量為縱坐標，列出直線回歸方程(y=ax+b)。
1.4.1.2 反應時間的選擇
將酶反應不同的時間（10~70 min），計算無機磷生成量與時間的關系。
1.4.1.3 酶濃度對酶活的影響
將酶稀釋不同的倍數（10 000~50 000），觀察酶分子的濃度對測定結果的影響。
1.4.1.4 離子強度對酶活的影響
配制不同濃度的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5 mol/l,在常規條件下測定酶活。
1.4.1.5 底物種類比較
分別用國產植酸鈉和Sigma植酸鈉配置底物進行酶活檢測，比較檢測結果。
1.4.1.6 底物濃度對酶活的影響
配制不同反應濃度（0.02～1 mmol/l）的底物，在常規條件下測定酶活，以最高酶活為100％，在其他條件下的酶活占最高酶活的百分數即為該酶在此底物濃度下的相對酶活。
1.4.1.7 底物存放時間對酶活的影響
配制10 mmol/l的植酸鈉溶液存放在4 ℃條件下，觀察存放時間對酶活測定值的影響。
1.4.2 酶反應的最適溫度
調節恒溫水浴鍋,在不同溫度下(15～55 ℃)進行酶促反應。以最高酶活為100％,在其它條件的酶活占最高酶活的百分數即為該酶在此溫度條件的相對酶活。
1.4.3 酶反應的最適pH值
配置0.1 mol/l的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,在不同的pH值下(2.0～8.0)進行酶促反應。以最高酶活為100％,在其它條件的酶活占最高酶活的百分數即為該酶在此pH值條件的相對酶活。
1.4.4 酶的pH值穩定性
用不同pH值的緩沖液在30 ℃下處理酶溶液30、60 min，然后調回最適pH值，在常規條件下測定酶活，考察酶在30 ℃下的pH值穩定性。以剩余最高酶活為100％，其他條件下的酶活占最高酶活的百分數即為該酶在此pH值條件的相對酶活。
1.4.5 酶的耐熱性
模仿飼料實際調質和制粒加工條件，觀察酶樣品在濕熱條件下的酶活變化。稱取適量酶樣品（粉酶與載體質量比為1：20）先與高能量載體充分混合（淀粉+面粉+玉米芯粉），然后置于85 ℃、相對濕度95%的恒溫恒濕箱中處理5 min，取出待其自然冷卻，再在常規條件下測定酶活，以酶樣品的原酶活為100％，經過恒溫恒濕處理后的酶活占原酶活的百分數即為該酶在此條件下的相對酶活。
1.4.6 金屬離子和螯合劑對酶活的影響
在緩沖液中分別添加質量分數為0.1％的CaCl2、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeCl2、NaCl、KCl、MnSO4、(NH4)2SO4、EDTA-Na2，在常規條件下測定酶活。
1.4.7 胃蛋白酶和胰蛋白酶對酶活性的影響
在稀釋好的1ml酶溶液中，先分別加入1 ml濃度為0.5 mg/ml的胃蛋白酶（用pH值為2.5，濃度為0.1 mol的緩沖液配制）和胰蛋白酶（用pH值為7.0，濃度為0.1 mol的緩沖液配制），然后在37 ℃分別處理30、60、120 min后，最后在常規條件下測定酶活。以未處理的酶活為100％，在其他條件下的酶活占其酶活的百分數即為該酶在此條件下的相對酶活。
1.4.8 中性植酸酶的酶動力學參數
配制不同濃度的植酸鈉溶液，在常規條件下測定酶活，利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法確定米氏常數Km和最大反應速度Vmax。
2 結果與分析
2.1 測定條件的分析
2.1.1 標準曲線的線性范圍（見圖1）

確定酶解產物與吸光度的標準曲線的線性范圍是酶活測定的前提,實驗發現,磷酸二氫鉀濃度的線性范圍為:磷酸二氫鉀濃度1~5 mmol/l,吸光度0.165～0.875。
如圖2所示，在70 min反應時間內，無機磷生成量與反應時間成正比例，為了統一測定方法，我們選擇30 min的反應時間。
2.1.3 酶濃度對酶活的影響
反應體系中，酶分子的濃度對測定結果也有重要影響。表1是中性植酸酶酶活測定值與樣品稀釋倍數的關系。

確定酶濃度就是確定酶分子的數量與底物分子數量之間的比例關系,只有二者的比例在一定的范圍內,酶分子的活力才能發揮最大的作用。實驗發現,酶活隨著酶濃度的升高有逐漸降低的趨勢,同時,隨著酶濃度的升高樣品的本底值也逐漸加大。因此,在酶活測定做樣品稀釋時,間隔不要太大,最好是倍增稀釋。
2.1.4 離子強度對酶活的影響（見圖3）
如圖3所示，隨著離子強度升高，酶活檢測值有所升高。溶液的離子強度影響酶分子的空間構象，從而影響了酶分子活力的發揮，在酶活測定過程中需要統一反應液的離子強度。在實驗過程中，我們選用0.1 mol/l的離子強度。

2.1.5 底物種類對酶活的影響（見表2）

實驗結果表明，用Sigma植酸鈉做底物，其酶活檢測值相當于國產植酸鈉的82.49%左右，經過反復多次的對比，兩種底物的檢測值都有相似的對應關系。國產植酸鈉完全可以替代Sigma植酸鈉用于中性植酸酶酶活的檢測,同時，其價格只有Sigma植酸鈉的0.5%，用國產植酸鈉可以大大降低檢測成本。
2.1.6 底物濃度對酶活的影響（見圖4）

如圖4所示，隨著底物濃度的增加酶活逐漸上升，當底物濃度足夠大時，酶全部被底物所飽和，此時反應速度達到最大值。隨著底物濃度的增加樣品空白的本底值逐漸增大，會影響酶活的測定。
2.1.7 底物存放時間對酶活的影響
大量實驗表明,長時間存放的底物,會造成較高的本底值,影響測定精度。我們分析了植酸鈉溶液存放在4 ℃條件下,底物存放時間對酶活的影響,結果見表3。

2.2 酶的最適反應溫度（見圖5）

如圖5所示，中性植酸酶隨著溫度的增加，酶活呈上升趨勢，到48 ℃酶活達到最高，溫度超過48 ℃后酶活開始下降，該酶的最適反應溫度為48 ℃。
2.3 酶的最適反應pH值（見圖6）

如圖6所示，中性植酸酶隨著pH值的增加，酶活呈上升趨勢，在pH值6.0達到高峰，然后隨著pH值上升酶活開始下降，在pH值5.0～6.5間，能保持70％以上的酶活。
2.4 酶的pH值穩定性（見圖7）

如圖7所示，在pH值2.0～9.0之間該酶仍可保持90％以上的活力，保溫不同的時間對酶的穩定性沒有什么影響，此酶有較強的耐酸性。
2.5 酶的耐熱性（見表4）

中性植酸酶經濕熱試驗箱85 ℃、95% RH處理5 min后，酶活仍能保存70.16％。
2.6 金屬離子和螯合劑對酶活的影響（見圖8）

如圖8所示， Zn2+對中性植酸酶有一定的抑制作用，Mn2+有輕微的激活作用。同時，酶活的表達不依賴于金屬離子的存在。
2.7 胃蛋白酶和胰蛋白酶對酶活的影響（見表5）

如表5所示，用胃蛋白酶處理中性植酸酶30、60、120 min后檢測，酶活殘留率分別為100.03%、99.06%和95.47%，該酶有較強的抗胃蛋白酶的能力。
用胰蛋白酶處理中性植酸酶30、60、120 min后檢測，酶活殘留率分別為77.24%、63.55%和45.57%，該酶抗胰蛋白酶能力較弱。
2.8 酶的反應動力學參數
利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法,以1/V對1/S作圖，得到一個直線（如圖9）。該酶的米氏常數Km=0.563 mmol/l,最大反應速度Vmax=6.250 μmol/(mg·min)。

3 結論
綜上所敘，該酶的最適反應溫度為48 ℃；最適反應pH值為6.0;在pH值5.0～6.5之間有較大的活性區間；有較強的耐酸性,在pH值2.0～9.0之間處理1 h仍有90％以上的活性；具有很強的耐熱性，經濕熱試驗箱85 ℃、95% RH處理5 min酶活能保存70％左右；Zn2+離子對酶活有一定的抑制作用，Mn2+離子對酶活有一定的激活作用；該酶抵抗胃蛋白酶的能力比較強，抵抗胰蛋白酶的能力較弱；該酶的米氏常數Km=0.563 mmol/l,最大反應速度Vmax=6.250 μmol/(mg·min)。
此酶的酶學性質與目前報道的中性植酸酶相比有一些特殊之處：①此酶具有很強的耐熱性，在飼料制粒過程中有一個短暫的高溫過程,一般在75～93 ℃。普通植酸酶在此高溫下不可避免的失活，而中性植酸酶經短暫的高溫處理酶活仍能保存70％左右，在制粒飼料中有廣泛的應用前景。目前的報道中，Kim等[4]報道的芽孢桿菌Bsp DS11植酸酶在90 ℃處理10 min后酶活可保留50%。Tye等[5]報道的地衣芽孢桿菌植酸酶在95 ℃處理15 min后酶活可保留61%。②有較強的耐酸性，在pH值2.0～9.0之間處理1h仍有90％以上的活性。③最適反應pH值為6.0偏中性，在pH值5.0～6.5間，能保持70％以上的酶活。鯉科魚類的腸道pH值在6.5到8.5的范圍內，是植酸酶的主要作用場所,與此酶的最適pH值相適應。④來源于枯草芽孢桿菌中性植酸酶對鈣離子具有較強的依耐性[6]，在本實驗中沒有發現類似現象，此中性植酸酶酶活的表達不依耐于金屬離子的存在。Zn2+對該酶有一定的抑制作用，Mn2+對該酶有輕微的激活作用。
理論上說，將中性植酸酶和酸性植酸酶配合使用，可以延長植酸酶在整個動物胃腸道中的作用時間、獲得更好的添加效果，王亞茹（2001）和張常明（2005）對此也做過研究。希望科研工作者加大對中性植酸酶的研究，共同促進飼料工業的健康發展！
參考文獻
[1] Abulh Jullah. Asperggijjus Ficuum Phytase: Partial Primary Structure, Substrate Selectivity and Kinetic Characterization[J]. Preparative Biochem., 1988,18:459-471.
[2] 付石軍, 孫建義. 中性植酸酶分子生物學研究進展[J]. 飼料工業，2005，26（16）:21-22.
[3] 李朝霞,王愛民,李小敏. 中性植酸酶高產菌株的篩選及產酶條件研究[J]. 微生物學報， 2007，34（4）：633-637.
[4] Kim Y O, Kee J K, Kim H K, et al. Cloning of therostable phytase gene(phy) from Bacillus sp DS11 and its overexpression in Escherichia coli[J]. FEMS Microbiology Letters, 1998(162):185-191.
[5] Tye A J, Siu F K Y, Leung T Y C, et al. Molecular cloning and the biochemical characterization of two novel phytases form B subtilis 168 and Blicheniformis[J]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, 59:190-197.
[6] 王亞茹,姚斌,曾紅,等. 枯草芽孢桿菌中性植酸酶的純化和酶學性質[J]. 微生物學報, 2001，41（2）：198-203.
（編輯：沈桂宇，guiyush@126.com）
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段壘、謝紅云、王天運，單位及通訊地址同第一作者。