有明顯原發性化膿病灶及較為典型的癥狀時，診斷不困難。高熱、皮膚及粘膜瘀點、重性黃疸、脾腫大、以及發病前的皮膚或傷口感染；上呼道感染，或泌尿系統感染，都是診斷敗血癥的重要線索。此外，進行性貧血、中性粒細胞相對或絕對增多和蛋白尿等，對診斷都有幫助。診斷沒確立前即用抗生素治療，尤其廣譜抗生素，每易掩蓋病情，給確診造成困難。對病情較嚴重或弱小嬰兒，一有敗血癥可疑跡象，即應作必要的有效治療，不得等候檢查結果。
遇到持續發熱、一般狀況虛弱、病因不明拖延日子已比較多的患兒。應該深入細致地檢查有無隱伏的感染灶。對有毛發掩蔽的皮膚、鼻竇、乳突、咽喉及其周圍組織、長骨和關節都要認真檢查。尿需要反復多次檢查。對心、肺、長骨關節等，如有必要，應進行X線透視或攝取相片。
敗血癥的最后診斷依據是，由血培養分離出病原菌。取得陽性血培養有賴于下面幾個關鍵：盡早在病的急性期取血培養；要在使用抗生素治療前進行，連續取血培養二次以上。爭取在寒戰發作或體溫驟升時取血，每次分別自兩個不同靜脈取血能提高培養陽性率，血量要適當。同時還得進行厭氧細菌培養。培養陽性細菌需做抗生素敏感試驗以利治療。
此外，可考慮四唑氮藍染料的還原試驗，這是白細胞吞噬與殺死細菌的作用。影響到四唑氮藍還原為甲臜（formazan）。此試驗在新生兒更可靠些，因正常新生兒白細胞趨向還原染料較年長兒為強，在年長兒中可出現假陽性。做鱟試驗測革蘭氏陰性桿菌內毒素，有助于診斷。