毛細管凝膠電泳色譜儀(CGE)是20世紀80年代后期發展起來的毛細管電泳分離模式。它是將常規凝膠電泳儀對生物大分子的分離能力與毛細管電泳儀的快速、微量和定量分析相結合,是當今分離度極高的一種分離技術。
一、載體特性:
采用聚丙烯酰胺凝膠作為載體的目是防止CGE電泳過程中分子的對流和擴散,使待測組分得到更有效的分離。載體應具備以下特性:
1、物理化學性質穩定,在電泳過程中不受環境因素的影響,保持原有的狀態和性能。
2、化學惰性,在電泳過程中不與緩沖液中的離子和待分離的生物大分子發生化學反應,不干擾生物大分子的電泳過程。
3、分布均勻,電滲小,結果重復性好。
凝膠分無機凝膠和有機凝膠,無機凝膠有多孔硅膠和多孔玻璃等,有機凝膠有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠和葡聚糖凝膠等。常用凝膠有聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠,應用zui多的是前者。
二、工作原理:
將聚丙烯酰胺等在毛細管中交聯生成網狀多孔凝膠,以凝膠作為載體進行電泳。由于凝膠多孔,具有類似分子篩的作用,荷質比相等但大小不同的分子,在電場作用下發生遷移,其遷移速度受到凝膠網狀結構的阻礙。大分子受到的阻力大,遷移速度慢,小分子受到的阻力小,遷移速度快,從而達到相互分離。
蛋白質、DNA和蛋白質-SDS聚合物等的荷質比與分子大小無關,在CZE分離模式中,淌度幾乎沒有差別,很難分離,采用CGE能獲得良好分離。CGE與LIFD相結合已成為DNA快速序列分析的優選方法。
三、凝膠柱制備:
1、凝膠柱:
CGE的關鍵是凝膠柱的制備。常用聚丙烯酰胺凝膠進行DNA片段分離和測序,用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定蛋白質和肽的分子量。
2、無膠篩分柱:
將單體丙烯酰胺(Acr)溶液中的交聯劑N,N′-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)的濃度降為零,得到低粘度線性非交聯的親水性聚合物溶液來代替高粘度交聯聚丙烯酰胺,仍有按分子大小分離的作用。
無膠篩分柱容易制備,功能可調節,使用方便,使用壽命長。柱內不作交聯反應,可避免形成氣泡。但分離能力比凝膠柱差。
四、特點:
1、優點:
(1)聚丙烯酰胺凝膠是CGE的理想載體。由于聚丙烯酰胺凝膠粘度大,抗對流性好,散熱性好,能有效減小組分的擴散,因此能限制譜帶展寬,所得峰形尖銳,分離度極高,是CE分離模式中柱效最高的(107TP/m)一種分離方法。
(2)待測組分與聚丙烯酰胺凝膠可生成絡合物,使分離度增加,防止組分在毛細管壁的吸附,并減小電滲流,有可能使組分在短柱上實現極好的分離。
(3)樣品用量少,可實現自動化,可用于大分子物質的微量制備和餾分收集。
(4)可分離從幾個到幾百萬個堿基對的DNA和蛋白質等大分子物質。
(5)毛細管SDS-PAGE可提供豐富的分子量信息,具有比常規SDS-PAGE更好的定性分析性能。
2、缺點:
(1)凝膠柱制備比較困難,使用壽命短。
(2)進樣端易堵,若有氣泡則難以除去,影響分離。
五、應用:
在分子生物學和蛋白質化學上應用十分廣泛。在分子生物學上實現了寡聚核苷酸純化、反應基因治療、DNA測序和PCR產物分析等,在蛋白質化學上用于多肽和蛋白質的分子量測定、原蛋白質和SDS結合蛋白質的分離等。
可用于其它帶電物質的分離,并可通過加入添加劑(如手性添加劑、離子對試劑和絡合試劑等)改變分離的選擇性。