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  • 發布時間:2019-04-12 14:58 原文鏈接: 毛細管區帶電泳(CZE)分離硝基苯酚異構體實驗

    實驗方法原理毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE):以高壓電場為驅動力,以電解質為電泳介質,以毛細管為分離通道,樣品組分依據淌度和分配行為的差異而實現分離的一種色譜方法。由于毛細管內徑小,表面積和體積的比值大,易于散熱,因此毛細管電泳可以減少焦耳熱的產生,這是CE和傳統電泳技術的根本區別。它有多種分離模式,可以采用液相色譜中的各種檢測方法。CE既可以分離帶電荷的溶質,也可以通過毛細管膠束電動色譜等分離模式分析中性溶質,CE的高分離效率、高檢測靈敏度,樣品用量極少等特點使它在生物醫藥樣品的分析中顯示出突出的優越性。

    CE所用的石英毛細管柱,在pH>3.0情況下,其內表面帶負電,和溶液接觸時形成了一雙電層。在高電壓作用下,一定介質中的帶電離子在直流電場作用下的定向運動稱為電泳。單位電場下的電泳速度稱為電泳淌度或電泳遷移率。電泳速度的大小與電場強度、介質特性、粒子的有效電荷及其大小和形狀有關。而雙電層中的水合陽離子引起流體整體地朝負極方向移動的現象叫電滲,單位電場下的電滲速度稱為電滲淌度。電滲速度與毛細管中電解質溶液的介電常數和粘度、雙電層的ζ電勢以及外加直流電場強度有關。粒子在毛細管內電解質中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和,正離子的運動方向和電滲流一致,故最先流出;中性粒子的電泳流速度為“零”,故其遷移速度相當于電滲流速度;負離子的運動方向和電滲流方向相反,但因電滲流速度一般都大于電泳流速度,故它將在中性粒子之后流出,從而因各種粒子遷移速度不同而實現分離。

    電滲是CE中推動流體前進的驅動力,它使整個流體像一個塞子一樣以均勻速度向前運動,使整個流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶質區帶在毛細管內原則上不會擴張。但在HPLC中,采用的壓力驅動方式使柱中流體呈拋物線型,其中心處速度是平均速度的兩倍,導致溶質區帶本身擴張,引起柱效下降,使其分離效率不如CE。

    硝基苯酚是弱酸性物質,其鄰、間、對位異構體由于pKa值不同,在一定pH值的緩沖溶液中電離程度不同。因此,它們在毛細管電泳分離過程中表現出不同的遷移速度,從而實現分離。
    實驗步驟

    1.打開毛細管電泳儀,預熱至檢測器輸出信號穩定。

    2.準確測量毛細管長度。距毛細管一端約15cm處去除約2mm的毛細管聚合物保護層,作為檢測窗口,并測量毛細管進樣端到檢測窗的長度。

    3.將毛細管的檢測窗口對準檢測器光路,并安裝好毛細管。

    4.依次用氫氧化鈉溶液(1.0mol·L-1)、二次蒸餾水、鹽酸溶液(0.1mol·L-1)、二次蒸餾水沖洗毛細管各5min,最后在毛細管注入緩沖溶液,并將毛細管的兩端分別插入位于電極處的緩沖溶液瓶中。將直流電壓調至20kV。

    5.待記錄儀基線穩定后,關閉高壓電源,用壓力進樣方式進樣,并設定進樣時間,待樣品峰出現后記錄其遷移時間,混合樣按同樣步驟進行操作,并記錄圖譜。

    6.改變外加電壓(如15kV或25kV)重復步驟4、5。

    7.實驗完畢后,關閉儀器電源,并用二次蒸餾水沖洗毛細管。

    展開 
    其他

    1.根據所得到的實驗數據,計算電滲速度、電滲淌度、各組分的電泳淌度、間硝基苯酚的理論塔板數。根據分離圖計算各組分之間的分離度。

    2.繪制外加電壓與電滲速度的關系圖,并給予解釋。


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