本應用簡報按照 Agilent SureSelectQXT WGS 文庫制備方案，介紹了 Agilent 4200 TapeStation 系統在工作流程中的樣品質量控制 (QC) 性能。基因組 DNA ScreenTape 分析法是對基因組 DNA 起始材料進行系列定量分析并提供完整性信息的可靠方法。安捷倫高靈敏度 D5000 ScreenTape 分析法可在測序前對擴增的標簽文庫進行分子量測定和定量分析。數據還表明，采用 DNA ScreenTape 分析法所獲得的結果與使用 Agilent 2100 生物分析儀系統和 Qubit 熒光計進行分析所得到的信息相一致。
前言
Agilent SureSelectQXT 全基因組文庫制備試劑盒可生成用于 Illumina 配對末端多重測序的文庫。SureSelectQXT 文庫制備對基因組 DNA (gDNA) 的起始量變化非常敏感。本方案建議使用 Qubit 儀器進行兩次系列熒光分析來定量。采用基因組 DNA ScreenTape 分析法在 Agilent 4200 TapeStation 系統上運行相同樣品，比較這兩種方法所獲得的結果。gDNA 起始量的偏差會導致所得片段分布不理想，使擴增文庫中過大或過小的 DNA 片段所占比例過高。這種效應可以通過由各種 gDNA 起始材料（從低豐度到高豐度）產生的額外文庫來說明。
擴增文庫使用安捷倫高靈敏度 D5000 ScreenTape 分析法及 4200 TapeStation 系統進行分析，將其結果與 SureSelectQXT 方案推薦的高靈敏度 DNA 分析法及 Agilent 2100 生物分析儀系統分析所得結果進行比較。
擴增文庫的分析結果顯示，高靈敏度 D5000 ScreenTape 分析與 2100 生物分析儀系統獲得的分子量和摩爾濃度結果相一致。
材料與方法
4200 TapeStation 系統 (G2991AA)、2100 生物分析儀系統 (G2939AA)、SureCycler 8800 熱循環儀 (G8800A)、用于 WGS 的 SureSelectQXT 文庫制備試劑盒 (G9682A)、高靈敏度 D5000 ScreenTape (5067-5592) 和試劑 (5067-5593)、基因組 DNA ScreenTape (5067-5365) 和試劑 (5067-5366)、高靈敏度 DNA 試劑盒 (5067-4626)，以及 OneSeq 參比 DNA 男性 (5190-8848) 購自安捷倫科技公司。NanoDrop 1000、Qubit 3.0 熒光計 (Q33216) 和Qubit dsDNA BR 分析試劑盒 (Q32850) 購自賽默飛世爾科技公司。使用區域功能來實現 DNA 文庫的定量測定。除非另有說明，否則所有分析均按照生產商的方案和指南進行。
結果與討論
圖 1 說明了使用 gDNA 作為起始材料生成全基因組測序 (WGS) 文庫的 SureSelectQXT 方案。簡而言之，樣品在一步酶解步驟中進行碎裂和接頭標記，然后進行 PCR 擴增，在此期間對接頭連接的片段進行擴增和標記。然后使用磁珠清潔擴增的接頭連接的文庫，并在測序前分析以確定合適的分子量、數量，并進行純度（不含接頭二聚體產物）評估。
gDNA 的數量和完整性
SureSelectQXT WGS 方案需要高質量的 DNA 樣品，以獲得最佳性能和 gDNA 起始材料的精確定量結果。按照該方案使用配有 dsDNA BR 分析試劑盒的 Qubit 儀器進行系列定量分析。將相同的樣品在 4200 TapeStation 系統和 NanoDrop 中均進行6次重復基因組 DNA ScreenTape 分析。圖2顯示了獲自 4200 TapeStation 系統、Qubit 和 NanoDrop 的數據，說明了基因組 DNA ScreenTape 分析法適用于對 gDNA 起始材料進行定量分析。采用UV 光譜法測定 gDNA 所得的量常會過高，這是由于其他緩沖液成分在 UV 光譜中也可能有吸收[4]。
此外，基因組 DNA ScreenTape 分析法可在同一 QC 步驟中客觀評價樣品完整性。樣品完整性由 TapeStation 分析軟件的 DNA 完整值 (DIN) 計算功能自動測定（圖 3）。
與其他系統不同的是，基因組 DNA ScreenTape 分析方法及 4200 TapeStation 系統只需 1 μL 樣品即可在一步分析中同時對質量和數量進行評價。
Agilent SureSelectQXT 全基因組文庫的片段分子量測定
除了 gDNA 起始材料的初始質量控制外，SureSelectQXT 方案還建議對擴增文庫進行質量控制，從而確保在測序前顯示整個片段的分子量范圍。片段平均分子量顯著小于 600 bp 可能表明碎裂反應中的 gDNA 過少，或者可能與測序數據的重復分析次數增加有關。相反，文庫中片段平均分子量過大（超過 1000 bp）可能表明碎裂反應中的 gDNA 過多，并且可能需要更高的 DNA 濃度以在測序反應中獲得最佳的群集密度。
為了證明這一點，制備起始量為 20、50 和 80 ng 的文庫，用 50 ng gDNA 樣品生成的文庫作為標準文庫。圖 4顯示了與 2100 生物分析儀系統相比，4200 TapeStation 系統在評估分子量測定方面的性能，通過用上述起始量對文庫進行三次重復區域分析來評估。圖中的數據展現了兩個系統所得的文庫分子量有很好的相關性。
不同 gDNA 起始量的電泳疊加圖顯示，使用 2100 生物分析儀 (A) 和 4200 TapeStation (B) 系統，文庫片段分子量分布（圖 5）呈現出不同的彌散條帶曲線。50 ng 的最佳 gDNA 起始量可得到平均分子量在 600–1000 bp 之間的文庫曲線。最小的 gDNA 起始量產生的文庫通常會導致其分子量范圍趨向于更小。相反，gDNA 起始量過大會導致大 DNA 片段比例過高，從而產生的文庫的分子量范圍趨向于更大。此外，所有電泳圖均未顯示接頭二聚體產物，表明文庫純度很高。
SureSelectQXT 全基因組文庫的定量分析
對于多重測序，將 SureSelectQXT 全基因組文庫合并，使每個插入標記的樣品在庫中的摩爾量相同。文庫的最佳起始濃度取決于測序平臺。它可能還需要根據文庫的 DNA 片段分子量范圍進行優化，以獲得所需的最終量和數據質量。4200 TapeStation 和 2100 生物分析儀系統可在區域表中提供摩爾濃度定量數據和分子量信息（圖 6）。
對于每個由不同 gDNA 起始量產生的文庫，將其摩爾濃度繪制在兩個系統的對比圖中（圖 7）。
表 1 中的匯總數據表明，使用高靈敏度 D5000 ScreenTape 分析法得到的擴增文庫的分子量和定量分析結果，與 SureSelectQXT WGS 方案推薦的 2100 生物分析儀系統及高靈敏度 DNA 分析法得到的結果相一致。
結論
本應用簡報證明了 Agilent 4200 TapeStation 是可用于 Agilent SureSelectQXT WGS 文庫制備過程中進行樣品分析的可靠系統。
高質量 DNA 樣品和 gD毛細管電泳（HPCE）的工作原理
高效毛細管電泳(high performance capillaryelectrophoresis，HPCE)是近年來發展起來的一種分離、分析技術，它是凝膠電泳技術的發展，是高效液相色譜分析的補充。該技術可分析的成分小至有機離子、大至生物大分子如蛋白質、核酸等。可用于分析多種體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，HPLC分析高效、快速、微量。
一、電泳遷移
不同分子所帶電荷性質、多少不同，形狀、大小各異。一定電解質及PH的緩沖液或其它溶液內，受電場作用，樣本中各組分按一定速度遷移，從而形成電泳。
電泳遷移速度(v)可用下式表示：
v=uE
其中E為電場強度(E=V/L，V為電壓，L為毛細管總長度)。u為電泳淌度。
二、電滲遷移
電滲遷移指在電場作用下溶液相對于帶電管壁移動的現象。特殊結構的熔合硅毛細管管壁通常在水溶液中帶負電荷，在電壓作用下溶液整體向負極移動，形成電滲流。帶電微粒在毛細管內實際移動的速度為電泳流和電滲流的矢量和。
三、分離分析類型
根據其分離樣本的原理設計不同主要分為以下幾種類型：
①毛細管區帶電泳(capillary zoneelectrophoresis，CZE)；
②毛細管等速電泳(capillarychromatography，CITP)；
③毛細管膠速電動色譜(miceller electrokineticcapillary chromatography，MECC)；
④毛細管凝膠電泳(capillarygelelectrophoresis，CGE)；
⑤毛細管等電聚焦(capillary isoelectricfocusing ，CIEF)。
毛細管區帶電泳(CZE)為HPCE的基本操作模式，一般采用磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液，實驗條件包括緩沖液濃度、pH值、電壓、溫度、改性劑(乙腈、甲醇等)，用于對帶電物質(藥物、蛋白質、肽類等)分離分析，對于中性物質無法實現分離。毛細管膠束電動色譜(MECC)為一種基于膠束增溶和電動遷移的新型液體色譜，在緩沖液中加入離子型表面活性劑作為膠束劑，利用溶質分子在水相和膠束相分配的差異進行分離，拓寬了CZE的應用范圍，適合于中性物質的分離，亦可區別手性化合物，可用于氨基酸、肽類、小分子物質、手性物質、藥物樣品及體液樣品的分析。毛細管等速電泳(CITP)采用先導電解質和后繼電解質，構成不連續緩沖體系，基于溶質的電泳淌度差異進行分離，常用于離子型物質(如有機酸)，并因適用較大內徑的毛細管而可用于微制備，但本法空間分辨率較差。毛細管等電聚焦電泳(CIEF)用于具兼性離子的樣品(蛋白質、肽類)，等電點僅差0.001可分離的物質。毛細管凝膠電泳(CGE)依據大分子物質的分子量大小進行分離，主要用于蛋白質、核苷酸片段的分離。此外，還有毛細管電色譜(CEC)及非水毛細管電泳(CNACE)，用于水溶性差的物質和水中難進行反應的分析研究。目前CZE和MECC用得較多，本文以這兩種方法為例來說明HPLC的原理。
四、CZE的基本原理
HPLC選用的毛細管一般內徑約為50μm(20～200μm)，外徑為375μm，有效長度為50cm(7～100cm)。毛細管兩端分別浸入兩分開的緩沖液中，同時兩緩沖液中分別插入連有高壓電源的電極，該電壓使得分析樣品沿毛細管遷移，當分離樣品通過檢測器時，可對樣品進行分析處理。HPLC進樣一般采用電動力學進樣(低電壓)或流體力學進樣(壓力或抽吸)兩種方式。在毛細管電泳系統中，帶電溶質在電場作用下發生定向遷移，其表觀遷移速度是溶質遷移速度與溶液電滲流速度的矢量和。所謂電滲是指在高電壓作用下，雙電層中的水合陰離子引起流體整體地朝負極方向移動的現象；電泳是指在電解質溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現象。溶質的遷移速度由其所帶電荷數和分子量大小決定，另外還受緩沖液的組成、性質、pH值等多種因素影響。帶正電荷的組份沿毛細管壁形成有機雙層向負極移動，帶負電荷的組分被分配至毛細管近中區域，在電場作用下向正極移動。與此同時，緩沖液的電滲流向負極移動，其作用超過電泳，最終導致帶正電荷、中性電荷、負電荷的組份依次通過檢測器。
五、MECC的基本原理
MECC是在CZE基礎上使用表面活性劑來充當膠束相，以膠束增溶作為分配原理，溶質在水相、膠束相中的分配系數不同，在電場作用下，毛細管中溶液的電滲流和膠束的電泳，使膠束和水相有不同的遷移速度，同時待分離物質在水相和膠束相中被多次分配，在電滲流和這種分配過程的雙重作用下得以分離。MECC是電泳技術與色譜法的結合，適合同時分離分析中性和帶電的樣品分子。
NA 起始材料高重現性的定量結果是成功制備 SureSelectQXT 文庫必不可少的條件。安捷倫基因組 DNA ScreenTape 分析法可對基因組 DNA 起始材料實現精確定量分析，并在同一 QC 步驟中對樣品完整性進行評估。
安捷倫高靈敏度 D5000 ScreenTape 分析法是用于 SureSelectQXT WGS 擴增文庫的分子量測定和定量分析的理想工具。4200 TapeStation 系統除了具有與 SureSelectQXT 方案推薦的Agilent 2100 生物分析儀系統等效的性能外，還具有高度靈活的樣品通量和易用性。