氯霉素乙酰基轉移酶（CAT）測定實驗

氯霉素乙酰轉移酶報告基因(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)能將乙酰基從乙酰輔酶A轉移到氯霉素上。本試劑盒采用熒光測定的方法，檢測CAT活性，它的靈敏度接近同位素測定方法，而操作極為簡便、快捷，成本也大為降低。使用通用裂解緩沖液，能與其他類型的報告基因檢測和蛋白含量檢測兼容。

細胞樣本

Tris-緩沖液 Tris 三硝基甲苯（Triton） CAT 稀釋緩沖液 CAT 酶標準物 閃爍液 聚丙烯閃爍杯

微量離心管 微量離心機

一、材料

滅菌物品

1. D-PBSA

2. 多孔培養板：6 孔，35 mm

非消毒物品

1. Tris-緩沖液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0

2. Tris/三硝基甲苯（Triton）：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，0.1%TritonX-100,4℃ 儲存

3. CAT 稀釋緩沖液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，50% 甘油，0.2%BSA

4. 底物：含 250 mmol/L 氯霉素（GIBCO）的 100% 甲醇；分裝，-70℃ 儲存

^{5. 14}C-CoA：¹⁴C-丁酸輔酶 A（10uCi/mL；AmershamPharmacia）

6. CAT 酶標準物：制備含 0.2、1.0、2.0、4.0、10U/mL 標準液的 CAT 稀釋緩沖液，4℃ 儲存

7.「雞尾酒」閃爍液：Econofluor（Invitrogen）

8. 去離子蒸餾水（DDW）

9. 聚丙烯閃爍杯：3.5 mL

10. 微量離心管

11. 微量離心機

12. 冰浴

方法A：6 孔、35 mm 培養板上的細胞收集

1. 轉染后 24~72 h，用 D-PBSA 液洗滌細胞。

2. 將培養板置于冰上，每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton。

3. 將培養板-70℃ 冷凍 2 h。

4. 于 37℃ 下解凍培養板，然后將其置于冰上。

5. 將細胞裂解物移至微量離心管中，以最大速度離心 5 min。

6. 收集上清液，65℃ 加熱 10 min，以滅活 CAT 抑制物質。

7. 最大速度離心 3 min 后收集上清液（細胞裂解物），將上清液保存在-70℃。

方法 B：CAT 測定

8. 從每一樣品中取 5~150uL 細胞裂解物，移至一個 3.5 mL 多聚丙烯閃爍杯中，并且加入足夠的 0.1mol/L Tris，終末體積為 150uL。

9. 設空白杯，加入 150uL 0.1mol/LTris 液，作為陰性對照。

10. 陽性對照：
（a）取 5 個閃爍杯，各加入 150uL 0.1mol/LTris。
（b）將 5uL 的 CAT 標準液加入到每個閃爍杯中，繪制 1、5、10、20、50mU 的 CAT 標準曲線。

11. 在所有樣品杯（包括對照）中，加入 100uL 以下混合液：
（a）84uL 超純水
（b）10uL 0.1mol/LTris
（c）1uL 的氯霉素
（d）5uL（50nCi）的 ¹⁴C-CoA

12. 擰緊杯蓋，于 37℃ 下孵育 2 h。

13. 向所有閃爍杯中加入 3 mL Econofluor，擰緊杯蓋。

14. 上下倒置混勻閃爍杯中成分。

15. 室溫下孵育 2 h。

16. 在一個液閃計數儀上測定 30s 閃爍次數。                                                                  

1. 在表達質粒擴增與制備一步，要特別注意其純度（不能含RNA和染色體DNA）以免影響轉化效率

2. 制備方法最好選用溶菌酶加Triton10，然后氯化艷梯度離心。

3. 一定要有對照組用CAT酶代替細胞提取液，來驗證反應及層析等過程的可行性，或用Psv:CAT和Psv。cAT表達質粒驗證轉化及重組兩步的正確性。

4. 在制備細胞提取液中最好選用超聲波破碎法，離心前要注意檢查破碎程度。凍融法繁瑣有時破碎不徹底影響結果。

5. 4mmol/L乙酞輔酶A可每次取1.smg溶在500川水中，最好用前配制，配制的溶液可保存于一20℃，但不可超過十天。

成功地組裝表達質粒是該項檢測技術的關鍵之一,表達DNA質粒必須具有下列幾種元件:（1）供細胞復制的原核編碼順序和供啼選用的標記基因(抗菌素基因);（2）控制真核細胞轉錄的調控元件(增強子、啟動子);（3）控制轉錄后的一些信號,轉錄加工裁剪信號,加尾信號,供在哺乳動物表達中用;（4）未知待測基因順序可取代上述的轉錄調控順序;（5）標記基因(氯霉素乙酸轉移酶)。

參考：
1、《動物細胞培養：基礎技術指南（第五版）》；
2、《霉素乙酞轉移酶檢測(CATassay)基礎醫學與臨床》