水體中大腸菌群的檢測（一）

實驗原理

所謂大腸菌群，是指在37℃培養24h 內能發酵乳糖產酸、產氣的兼性厭氧的革藍氏陰性無芽孢桿菌的總稱。主要由腸桿菌科中四個屬內的細菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。

水的大腸菌群數是指100 mL水檢樣內含有的大腸菌群實際數值，以大腸菌群最近似數（MPN）表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽孢桿菌等多種細菌。這些細菌都可以隨人畜排泄物進入水源，由于大腸菌群在腸道內數量多，所以，水源中大腸菌群的數量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標。目前，國際上已公認大腸菌群是糞便污染的指標。因而對飲用水必須進行大腸菌群的檢查。

水中大腸菌群的檢測方法，常用多管發酵法和濾膜法。多管發酵法可適用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要的時間較長。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用于雜質較多、易于堵塞濾孔的水樣。

材料與器皿

(—)培養基

1、普通乳糖蛋白胨培養液

蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化鈉 5g，1.6％溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸餾水 1000mL，pH 7.2~7.4。

將蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調節pH為7.2~7.4，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管10mL，115℃滅菌20min。

2、三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液

按上述普通乳糖蛋白胨培養液濃縮三倍配制，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管5mL。

1、 品紅亞硫酸鈉培養基（供平板分離用）

蛋白胨 10g， 乳糖 10g，K2HPO4 3.5g，瓊脂 15～20g，蒸餾水1000mL，無水亞硫酸鈉 5g，5％的堿性品紅乙醇溶液 20mL，pH 7.2~7.4。

4、伊紅美藍培養基（EMB培養基）（供發酵法平板分離用，3和4可任選一種）

蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，2％伊紅（曙紅）水溶液 20mL，5％美藍（亞甲藍）水溶液13mL，pH 7.2~7.4。

(二)滅菌移液管、滅菌稀釋水、試管、杜漢氏小管、革蘭氏染色液、滅菌培養皿。

實驗過程

(一)水樣的采集

供細菌學檢驗的水樣，必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證再運送、貯存過程中不受污染。水樣從采集到檢驗不應超過4h ，在0～4℃下保存不應超過24h ，如不能在4h 內分析，應在檢驗報告上注明保存時間和條件。

1、自來水取樣：應在水龍頭打開放水5min ，再用無菌容器接取水樣，待分析。如水樣內含有余氯，則采樣瓶滅菌后按每500mL水樣加3％Na2S2O3.5H2O溶液1mL。

2、江、河、湖、池自然水體取樣：可用采樣器，采樣瓶應先滅菌。采樣后，瓶內應留有空隙。如果與其他化驗項目聯合取樣，細菌學分析水樣應采在其他樣品之前。

（二）初發酵試驗

1、水樣稀釋：制備水樣10^-1、10^-2的稀釋液，方法為用無菌移液管吸取水樣10mL放于盛有90mL無菌水和若干玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩使混合均勻，并使其中的細菌盡量呈單個存在，即為10^-1稀釋液；再從10^-1制備10^-2稀釋液。以此類推，稀釋到所需倍數。

2、接種和培養：以無菌操作于5支三倍濃縮培養基（接種前一定應先檢查杜漢氏小管內有無氣泡）中各加入水樣10mL，5支普通培養基試管中加入水樣1mL，5支普通培養基試管中加入10^-1稀釋液1mL， 小心混勻放入37℃培養箱中培養24h 。此即5管法。

3、結果觀察：37℃中培養24h后取出觀察，觀察有無氣體（杜漢氏小管內有無氣體）和酸產生（培養基有無變色）。在48h之間，培養管內倒置的杜漢氏小管內有任何量的氣體積累，或培養基顏色從紫色變為黃色，便可初步斷定為陽性反應。

若實驗所測定的15支管中均為陽性反應，說明濃水樣污染嚴重，可將樣品進一步稀釋后，再按上述方法接種、培養和觀察。