水稻葉片和根蛋白質的納升級二維液相色譜串聯...（一）

水稻葉片和根蛋白質的納升級二維液相色譜串聯質譜實驗

實驗材料 反相裝填材料

試劑、試劑盒 緩沖液HPLC 級乙腈HPLC 級甲醇氯化鈣溶液碳酸氫銨溶液

儀器、耗材 離子講串聯質譜儀

實驗步驟

3.1 葉片和根組織的取材以及蛋白質沉淀

( 1 ) 從植物的中部切取未衰老的綠色葉片，立即放入自封塑料袋中冷凍。如果沒有冷凍設備，可先放在冰上，然后再放到 -20°C 保存。

( 2 ) 挖出植物根系，在綠色莖段以下一英寸的地方取材。抖動根系，并快速的依次放入 3 個大燒杯中洗去土壤，然后再放入自封塑料袋中冷凍，或暫時保存在冰上。

( 3 ) 稱取 2.5 g 去除了莖稈和其他物質的冰凍葉片和根系，用預冷的剪刀剪碎樣品后 ，放入預冷的陶瓷研缽中，加液氮研磨至粉末，需要多次添加液氮，以保持組織的冰凍狀態。

( 4 ) 把冰凍的葉片或根系粉末放入 40 ml 離心管中，加入 25 ml 葉片重懸液，振蕩混合，確保所有的粉末被重懸起來后，在 -20°C 下靜置 45 min，再振蕩搖勻，35000 g 離心 15 min。

( 5 ) 用玻璃移液管吸去上清液，注意不要擾動沉淀。用等體積的 EDTA 洗液洗滌沉淀。振蕩打散沉淀，冰上靜置 5 min，35000 g 離心 15 min。重復操作至少兩次，直到葉片蛋白質沉淀不再有綠色。

( 6 ) 冰凍干燥沉淀物，得到含有蛋白質、細胞壁和纖維的淡褐色材料。

3.2 從三氯乙酸/丙酮沉淀的粉末中制備蛋白質樣品

( 1 ) 針對每個樣品，分別稱取 20 mg 的三氯乙酸/丙酮沉淀粉末（制備方法見 21.3.1 ) 放入有蓋的 1.5 ml 離心管中。

( 2 ) 在每只管中加入 1 ml 的 100 mmol/L Tris-HCl  ( pH 8.5 ) ，渦旋振蕩 1 min，18000 g 離心 10 min，棄上清液（見注釋 1)。

( 3 ) 在每只管中加入 500 μl 的 8 mol/L 尿素，渦旋振蕩 5 min，超聲波水浴處理 10 min，然后旋轉振蕩 30 min。

( 4 ) 18000 g 離心 10 min，將約 400 μl，含蛋白質濃度為 0.1~0.5 μg/μl ( 見注釋 2 ) 的上清液移至另一只管中。

( 5 ) 用 8 mol/L 尿素重復第 3 和第 4 步驟，合并上清液，調整容積到 600 μl。

3.3 抽提蛋白質的蛋白酶消化

( 1 ) 在總容積為 600 μl 的蛋白抽提液中添加 5 μl 外切賴氨酸蛋白酶工作液，在旋轉振蕩器上 37°C 消化過夜（見注釋 3) 。

( 2 ) 在每個樣品中分別加入 2300 μl 的 100 mmol/L 碳酸氫銨，30 μl 的 100 mmol/L 氯化鈣，60 μl 的乙腈，10 μl 的胰蛋白酶工作液。終濃度為：1.6 mol/L 尿素，76 mmol/L 碳酸氫銨，1 mmol/L 氯化鈣，2% ( V/V ) 乙腈，3.3 ng/L 胰蛋白酶。

( 3 ) 在旋轉振蕩器上 37°C 消化 24~48 h。添加 60 μl 甲酸使終濃度為 2%，將樣品保存在 -20℃ 備用。

( 4 ) 用 15 ml 含有 0.1% 甲酸的 90% 乙腈溶液平衡 C18 SeP- Pak 層析柱，然后用 20 ml 含有 0.1% 甲酸的雙蒸水清洗柱子 4 次。

( 5 ) 吸取 3 ml 蛋白酶消化液加樣到已平衡好的 C18 Sep-Pak 層析柱上，收集流出的液體，再重復慢速過柱兩次。用 20 ml 含有 0.1% 甲酸的雙蒸水洗柱子，洗脫鹽及其他松散結合物質。再用 3 ml 含有 0.1% 的甲酸的 90% 乙腈溶液將肽段從 C18  Sep-Pak 柱上洗脫下來。

( 6 ) 用真空干燥濃縮機將上述洗脫液濃縮到約 500 μl。16000 r/min 離心 10 min，如果還有沉淀，取上清液，去沉淀。繼續用真空干燥濃縮機濃縮樣品到 50 μl，用含有 0.1% 甲酸的雙蒸水稀釋到 200 μl。

( 7 ) 用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的 90% 乙腈溶液平衡 C18 Spec- Plus 固相萃取移液器吸頭，然后用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的雙蒸水沖洗 5 次。

( 8 ) 吸取 200 μl 肽段溶液加樣到已平衡好的 C18 Spec-Plus 固相萃取移液器吸頭上，收集流出的液體，再重復慢速過柱兩次（見注釋 4) 。用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的雙蒸水沖洗柱子 5 次，然后用 300 μl 含有 0.1% 甲酸的 90% 乙腈溶液將肽段洗出。

( 9 ) 用真空干燥濃縮機將上述洗脫液濃縮到約 10 μl，此溶液可直接上樣到雙相 Mudpit 層析柱。

3.4 制備帶噴霧發射器的二維（SCX/RP) 納升級高效液相色譜層析柱

( 1 ) 層析柱的制備：將一根長 25 cm，內徑為 100 μm，外徑為 360 μm 熔融石英毛細管推入一個激光拉制儀中，留一截 3~8 μm 的熔融石英毛細管頭部。這樣它既可以用作離子源針頭，也可用作連接到質譜儀進樣口的層析柱 [ 25 ]。

( 2 ) 將裝有懸浮在甲醇溶液里填充材料的微型離心管放入壓力室中，并蓋好蓋。將毛細管的鈍頭用金屬箍與上蓋擰緊相連，深度與填充物質一致，擰緊金屬箍后，氣室加壓到 500 psi，將懸浮在甲醇溶液中的填充材料推入到層析柱中，當填充材料被裝填到毛細管的 3~8 μm 的尖頭時，甲醇通過柱子流向其頂部，在毛細管中先裝入 4 cm 強陽離子交換（SCX ) 填充物，然后再裝入 8 cm 反相層析（C-18 ) 填充物。

( 3 ) 用 PEEK T 形管連接器將填充好的柱子與高效液相色譜（HPLC) 連接，這個 T 形管連接器的金線電極（與質譜儀的高壓電源相連）為層析柱上游提供電壓，與柱子的洗脫溶液形成液相連接。

( 4 ) 用 HPLC 緩沖液 B 洗層析柱 1 h，流速為 1 μl/min，使柱體填充物完全填實。

( 5 ) 在使用前，用 HPLC 緩沖液 A 平衡柱子 1h，流速為 1 μ/min。