水質糞大腸菌群的測定濾膜法（二）

2 無菌濾膜：

直徑50 mm,孔徑0.45卩m的醋酸纖維濾膜，按無菌操作要求包扎，經12TC 高壓蒸汽滅菌20 min,晾干備用；或將濾膜放入燒杯中，加入實驗用水，煮沸滅菌3次，15 min/次，前2次煮沸后需更換水洗滌2~3次。
 

6. 3無菌水：取適量實驗用水，經121°C高壓蒸汽滅菌20 min,備用。

6.4 硫代硫酸鈉（Na2S2O3*5H2O）。

6.5 乙二胺四乙酸二鈉（CioHi4N208Na2.2H2。）。

6. 6 硫代硫酸鈉溶液：p （NazSzCh） =0.10 g/ml

稱取15.7 g硫代硫酸鈉（6.4）,溶于適量水中，定容至100 ml，臨用現配。

6.7 乙二胺四乙酸二鈉溶液：p （Ci₀Hi₄N2O₈Na2-2H2O） =0.15 g/ml

稱取15 g乙二胺四乙酸二鈉（6.5）,溶于適量水中，定容至100 ml,此溶液可保存30 d。

7儀器和設備

7. 1采樣瓶：1L、500 ml或250 ml帶螺旋帽或磨口塞的廣口玻璃瓶。

7.2高壓蒸汽滅菌器：115°C、12 PC可調。

7.3恒溫培養箱：允許溫度偏差44.5°C ±0.5°C ?

7.4過濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵，抽濾壓力勿超過-50 kPa。

7.5 pH計：準確到0.1 pH單位。

7. 6培養皿：直徑90 mm。

7.7 一般實驗室常用儀器和設備。

注：玻璃器皿及采樣器具試驗前要按無菌操作要求包扎，121笆高壓蒸汽滅菌20 min備用。

8樣品

8. 1樣品采集

點位布設及采樣頻次按照GB/T 14581、HJ/T494和HJ/T91的相關規定執行。

采集微生物樣品時，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。樣 品采集量可根據水體實際情況而定，一般不少于250 ml。

采集河流、湖庫等地表水樣品時，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，約距水 面10-15 cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶內然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水 中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣 品采集完畢后，迅速扎上無菌包裝紙。

從龍頭裝置采集樣品時，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開至最大，放水3?5 min, 然后將龍頭關閉，用火焰灼燒約3 min滅菌或用70%?75%的酒精對龍頭進行消毒，開足龍 頭，再放水1 min,以充分除去水管中的滯留雜質。采樣時控制水流速度，小心接入瓶內。

采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。

在同一采樣點進行分層采樣時，應自上而下進行，以免不同層次的攪擾。

如果采集的是含有活性氯樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（6.6）,以除去 活性氯對細菌的抑制作用（每125 ml容積加入0.1 ml的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的是重 金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.7）,以消除干 擾（每125 ml容積加入0.3 ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。

注：15.7 mg硫代硫酸鈉（6.4）可去除樣品中1.5 mg活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據樣品實際活性氯 量調整。

8. 2樣品保存

采樣后應在2h內檢測，否則，應10°C以下冷藏但不得超過6h。實驗室接樣后，不能 立即開展檢測的，將樣品在4°C以下冷藏并在2 h內檢測。

9分析步驟

9. 1樣品過濾

根據樣品的種類判斷接種量，最小過濾體積為10ml,如接種量小于10ml時應逐級稀釋。 先估計出適合在濾膜上計數所使用的體積，然后再取這個體積的1/10和10倍，分別過濾。理 想的樣品接種量是濾膜上生長的糞大腸菌群菌落數為20?60個，總菌落數不得超過200個。

當最小過濾體積為10 ml,濾膜上菌落密度仍過大時，則應對樣品進行稀釋。1:10稀釋的方法 為：吸取10ml樣品，注入盛有90 ml無菌水（6.3）的三角燒瓶中，混勻，制成1:10稀釋樣品。 樣品接種量參考

表見表1。

表1接種量參考表

 
用滅菌鑲子以無菌操作夾取無菌濾膜（6.2）貼放在己滅菌的過濾裝置（7.4）上，固定 好過濾裝置，將樣品充分混勻后抽濾，以無菌水（6.3）沖洗器壁2?3次。樣品過濾完成后， 再抽氣約5 s,關上開關。