優化和多光譜建模 啟始成像和研究設置包括用于優化設置和建模的初始步驟： 1- 熒光團成像（體外） 2- 生成光譜模型 3- 體內模型評估 首先，我們建議您使用上文確定的濾光片對稀釋后的熒光團進行成像。一旦采集到圖像，通過將高斯曲線擬合到熒光團的實驗曲線來創建光譜曲線（圖7）。 應用光譜模型 一旦光譜曲線實現了優化，模型就可以直接被調用到之后的數據集里，無需修改。如需將現有模型應用到新的數據集中，則選擇“分離圖像”面板中的“+”，選擇所需模型和“分離（Unmix）”按鈕（見圖 8）。系統采用適合求解多光譜模型的最小二乘法，將模型分配給各個像素（4）。為此，每個像素中的光譜總和需要與參考圖譜庫中的所有可能的組合總和相匹配。分離算法還添加了一些額外的限制（如非負性）。因此，成功進行光譜分離的關鍵就在于獲取圖譜庫熒光團的準確光譜。一旦確定各個熒光團中的光譜作用，所采集的疊合圖像就可以被分離成各個熒光團的獨立圖像。 每個“分離”圖像都由來自單獨“通道”的重疊圖像組成（以上述 Alexa 680 和 Alexa 700 為例）。各個圖像都可以在布魯克MI軟件中打開，并使用感興趣區（ROI）應用的相關數據進行分析，例如，平均值、總和和凈光強度、面積和周長以及自動ROI查找功能和圖像數學。換句話說，相機測量的強度可能與動物體內發光物質釋放的“真實”信號強度以復雜方式有相關性。傳感器捕捉到信號之后，接下來的多光譜分析可以定量產生準確的成分特定數據（1）. 傳染病、腫瘤學和納米粒子示蹤研究中的多光譜成像 使用綠色或紅色基因熒光報告或乃至多個 NIR 熒光團的研究可以受益于熒光光譜建模。使用多光譜成像可以識別和建模報告基因的不同光譜曲線，從而減少自體熒光。圖 9 和 10 顯示了采用多光譜方法扣除組織自體熒光的感染利什曼原蟲的兔足墊模型成像（M. Leevy，美國圣母大學，未出版）。 在另一個例子中，多光譜成像被用于一項體內聚合物粒子示蹤研究（5）。注射 4 小時后，在肝臟區域（圖 11）檢測到標記為Cy7 的顆粒，在 GI 區域獲得的可能由食物葉綠素產生的串擾信號被分離，提供了顆粒信號的清晰定位。 在一項納米顆粒/腫瘤研究中，在同一腫瘤小鼠中檢測到了不同大小的納米顆粒生物分布（6）。納米顆粒被差異標記，多光譜成像也用于分離循環納米顆粒的信號（圖 12）。 釋放體內熒光成像的所有潛能
