活細胞實時動態成像儀讓科研更輕松

目前，大部分的細胞檢測方法采用的仍然是傳統的終點法——僅僅給出最終結果，而且往往需要標記細胞和破壞細胞。這種方法無法得到細胞在生長時的真正狀態，也無法對細胞的生長過程做出動態的監測和分析。美國 Essen 公司開發了第二代長時間實時動態活細胞成像分析儀——IncuCyte ZOOM，用一種非侵入式的方法，記錄活細胞的實時生長狀態，并在成像的同時進行定量分析。這種成像方法，被稱為“定量實時細胞成像”（Quantitative Live-cell Imaging），無需設置實驗終點，細胞在培養的同時進行實時成像和定量分析，并提供多種應用模塊，可遠程控制，擴充了用戶記錄和理解細胞形態、細胞生長和細胞行為的途徑。

美國 Essen 公司的 IncuCyte ZOOM 是長時間、實時動態、非傷害式的活細胞成像分析平臺。儀器分為顯微成像器和控制器兩部分，顯微成像器可放置于培養箱中，中間放置多種規格尺寸的標準耗材（板、皿、瓶及載玻片均可），在其下方有顯微照相設備，通過自動對焦、自動拍攝，對培養細胞進行連續的監測，并通過聯網的電腦進行遠程控制、數據讀取與分析。系統可自動收集每個時間點的相差圖像和紅/綠熒光圖像。用戶除了可以得到各種格式的圖像或動態錄像外，還可以得到由系統軟件自動依據覆蓋度（Confluence，也翻譯成融合度、飽和度）和計數分析（Cell Count）生成的基于圖像數據的圖表，以顯示細胞的變化及趨勢。如顯示細胞增殖的覆蓋度 vs 時間圖表，顯示劃痕實驗的相對傷口密度 vs 時間圖表，顯示新生血管的血管長度 vs 時間圖表，或顯示神經生長的神經突長度 vs 時間圖表。

IncuCyte 物鏡可選擇 4×，10×，20×，可由用戶自行更換。在4倍物鏡下對 6-384 孔微孔板均可進行全孔成像。安裝物鏡的接頭還可安裝記號筆（Marking Tool），用軟件操作，即可在容器底部進行物理標記，方便后續實驗觀察，見圖 2。

圖 1：培養箱中的 IncuCyte ZOOM

圖 2：上左圖：軟件標記，上右圖：用記號筆在培養皿底部進行物理標記，下圖：記號筆和物鏡

IncuCyte 的優勢如下：

1）培養的細胞用高清晰度相差顯微鏡或熒光顯微鏡直接監測，為非破壞性的監測，細胞不用染色便可以觀察監測，影像效果好；

2）培養環境由商用培養箱提供，監測過程中細胞無需離開培養箱，不用擔心培養條件的改變對細胞的影響；

3）真正的長時間的動態活細胞成像，可達數周或數月；

4）高清晰度相差成像能消除微孔板的彎液面缺陷，且沒有傳統顯微系統的光暈問題，可以在 384 微孔板內監測細胞形態；

5）圖像處理軟件自動依據覆蓋度和計數分析，量化細胞增殖，自動輸出細胞生長曲線和 IC50、EC50 值；

6）實時監控，可改變傳統的“終點法”實驗方法，數據豐富，更準確、更靈活；

7）高通量，可同時監測6塊標準規格的細胞培養板/皿/瓶，細胞在 384 微孔板內實驗，可以減少寶貴的藥品消耗，見圖 3；

8）支持超過 200 種的標準培養容器，無需特殊的培養容器，節約后期實驗成本；

9）可遠程監控，進行數據讀取和分析，無需反復出入細胞房，避免了潛在的污染隱患及人工出入觀測之麻煩。

圖3：IncuCyte 內部結構，支持超過 200 種標準培養容器，可同時觀察多達6塊微孔板

圖 4 是IncuCyte 記錄的細胞增殖的高清晰度相差圖像和覆蓋度vs.時間的增殖曲線，黃色為軟件對細胞圖像的分割顯示。IncuCyte 也可對熒光圖像生成細胞數目 vs.時間的增殖曲線。最后圖像會被導出成單獨的 JPEG 文件或視頻。

圖 4：IncuCyte 記錄的細胞的相差圖像和增殖曲線

IncuCyte 的主要軟件功能：

1）用戶可以在任何一臺聯網的計算機上操控儀器，而無需反復拿進拿出標本及出入細胞房，這使 IncuCyte 成為了一個“虛擬的培養箱”。

2）IncuCyte 最好的特點之一就是直觀的軟件界面設計。用戶可以在軟件的操作界面上定義耗材的類型、拍攝的時間、位置及視野個數，見圖 5。

3）支持在長時間拍攝過程中插入其他拍攝任務繼續進行拍攝，以充分利用儀器。

4）IncuCyte 可以自動對焦，自動進行圖像收集。對得到的圖像也可以進行亮度、尺寸、對比度的顯示控制。可以設置細胞尺寸、偏心率等參數，過濾背景雜質。

5）用戶可以自定義樣本信息，進行分組分析，并可以電子化標記器皿，設定關鍵詞，必要時可用設定的關鍵詞搜索數據庫，方便查詢過去任何時間得到的圖像和數據。

6）用戶還可以直接從軟件中抓取圖像、圖表、曲線至 Word、Excel、PowerPoint 和 Email 中。生成的所有數據均可存檔，并且數據和圖表可以打包封存，便于用戶帶回家分析。

7）IncuCyte ZOOM 的新特性包括多熒光圖像處理模塊和新的相差成像處理模塊。

8）ZOOM 還設計了新的數據庫，使用戶能更容易查找和檢索實驗數據。

圖 5：軟件操作界面

IncuCyte 的基礎應用包括（無需套件）：

1）監測細胞增殖（Proliferation）：通過實時動態成像，對細胞增殖進行非侵入性的、定量的分析；

2）細胞培養質控（Cell Culture QC）/細胞培養優化（Cell Culture Optimization）：通過實時動態成像，可生成基于細胞覆蓋度和細胞個數的動態生長曲線；

3）監測細胞毒性（Cytotoxicity）：將染料和細胞混合然后監測，操作者可離開，是基于染料的實驗；

4）監測細胞凋亡（Apoptosis）：將凋亡試劑和細胞混合然后監測，操作者可離開，是基于染料的實驗；

5）監測報告基因（Reporter Gene）：用熒光蛋白標記細胞，細胞無需裂解，可獲得實時動態數據；

6）監測干細胞生長及重編程（Stem Cell Monitoring & Reprogramming）：可實時監測干細胞生長的全過程及重編程現象；

7）稀釋克隆（Dilution Cloning）：可實時跟蹤單細胞生長成克隆的全過程；

8）三維腫瘤球體成像（3D-Spheroid）：可自動計算 3D 腫瘤球體的生長和收縮，實時動態地定量球體參數；

9）免疫細胞殺傷（Immune Cell Killing）：可實時動態觀察和分析免疫細胞介導的對腫瘤細胞的殺傷作用；

10）免疫細胞聚集及增殖（Immune Cell Clustering and Proliferation）：可實時動態觀察和定量分析免疫細胞的聚集和增殖。

IncuCyte 開發了很多滿足特殊應用的套件，配有特別設計的定量分析軟件。需要套件的應用包括：

1）監測細胞遷移（Cell Migration）/細胞侵襲（Cell Invasion）：配套高度一致性的96孔傷口劃痕工具Wound Maker，實時動態監測傷口的愈合過程，可得到細胞進行劃痕遷移運動的定量指標；

2）監測趨化運動（Chemotaxis）：配套專門的 96 孔板，定量分析貼壁細胞和懸浮細胞在趨化因子作用下的類似Transwell方法的細胞遷移（Migration）運動；

3）監測血管新生（Angiogenesis）：使用通過驗證的血管新生試劑盒，具有動態分析血管新生的定量指標；

4）神經生長跟蹤（Kinetic NeuroTrack）：可分別在相差和熒光成像基礎上定量分析神經元細胞的神經突的生長狀況。

以下我們重點講述基本應用（細胞毒性、細胞凋亡、報告基因、干細胞生長、稀釋克隆、三維腫瘤球體成像、免疫細胞殺傷、免疫細胞聚集和增殖）和需要套件的應用（細胞遷移、細胞侵襲、趨化運動、血管新生和神經跟蹤）。細胞增殖、培養質控、細胞培養優化的原理見圖 4 即可。

IncuCyte ZOOM：第二代長時間動態活細胞成像及數據分析系統的特點和應用（第二版）

總結：

以上一些關鍵的重要的應用介紹，展示了 IncuCyte ZOOM 系統在定量的、非入侵性的、實時細胞分析上的作用。非標記、非損傷性的成像技術以及數據分析可以讓用戶獲得高質量的圖像、錄像和數據。與其他利用電子阻抗監測細胞不同，IncuCyte 可以記錄細胞形態，得到圖像和動態的錄像。另外，Essen 還開發出更多的活細胞實時動態觀察試劑盒（live cell kinetic assays and reagents），與 ZOOM 配套使用，進行實驗開發（assay development）、技術評估（technology assessment）、外包服務（fee-for-service outsourcing）和藥物開發合作（drug discovery partnerships）。