活細胞成像是直接把培養的細胞放到工作站嗎

一、活細胞成像系統原理
目前主流的活細胞成像系統從原理上可以分為兩大類：
基于寬場反卷積技術
基于共聚焦技術
兩種技術作為目前最流行的活細胞成像技術，均可以實現在維持細胞存活的情況下，快速獲取單一焦平面的信號，在具體性能上則各有擅長。
寬場反卷積技術
對光線進行反卷積運算是光學成像領域的成熟技術，最早由美國國家航空航天局開發并成為觀察微弱天體信號的標準技術。去卷積和共聚焦技術是光學顯微鏡領域獲得單一焦平面光線的兩大主流技術(J.M.Murray， live cell imaging， 2010)。通過將非焦平面的光線還原至焦平面上，大大提高了樣品信號的強度以及圖像的信噪比。由于去卷積技術設計到大量的后期運算，因此在高性能計算機發明以前，一直受制于運算能力，沒有得到大規模的推廣。隨著近年來計算機性能的大幅提升和價格的下降，去卷積技術逐漸成為光學顯微鏡的主流技術。一個點光源經過顯微鏡的光路，由于鏡片對光線的衍射和散射，最終呈現在觀察者面前的是一個模糊的點，所以點光源變成模糊的點的過程即為卷積。反卷積就是把模糊的點還原成點光源的過程。
以API 公司的DeltaVision 系統為例，其反卷積過程經歷以下幾步：
1)首先通過無數的計算和實驗，得到點光源經過顯微鏡物鏡后變模糊的規律，建立模型。
2)選擇完美的物鏡，保證樣品信號經過物鏡后變模糊的規律符合步驟一中得到的模型。
3)將通過顯微鏡光路的所有的光信號進行收集，因為點光源經過顯微鏡光路后會變成一個空間中的倒圓錐形，所以在收集信號的時候需要很準確的記錄信號的Z 軸信息。
4)對收集到的所有光信號按照步驟一中的模型進行還原，最終將模糊的點還原成清晰的點，客觀反映它在空間的位置和強度。
目前去卷積技術越來越廣泛地應用于生物學圖像的研究中。
共聚焦技術
共聚焦顯微鏡它采用點光源(point lightsource) 照射標本，在焦平面上形成了一個輪廓分明的小的光點(light spot ) ，該點被照射后發出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到探測器。探測器前方有一個針孔(pinhole) ，幾何尺寸可調。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測針孔范圍之內，而其它來自焦平面上方或下方的散射光，都被擋在探測針孔之外而不能成象。光束掃描器又分為單光束、多光束或狹縫掃描器幾種。其中單光束掃描獲得的圖像質量最好，狹縫掃描器雖然產生圖像的速率很高(可達實時水平) ，但其圖像信噪比低于單光束掃描，這是因為從狹縫長軸來的漫射光不能被有效遮擋。多光束掃描如碟片式共聚焦是由電動馬達驅動Nipkow 盤旋轉而實現的，其熒光量較低，速率一般較高。

寬場反卷積技術與共聚焦技術比較表

二、API 高分辨活細胞成像系統的主要特點
DeltaVision 活細胞成像系統有以下優勢：
1）高靈敏：得益于精密和高效的光路，以及領先的還原型反卷積技術，DeltaVision 將寬場顯微鏡的靈敏度和分辨率提高到新的水平，標準配置下最低可以探測到13個GFP 分子，成為目前為止最靈敏的光學顯微系統之一。

HIV 病毒通過DC 細胞和T 細胞的接觸侵染T 細胞，綠色顆粒為HIV 病毒
2）高速：標配下可達到 21 幀/秒（512×512）的成像速度。當配備EM-CCD 后，最高可達到224 幀/秒（64×64），可用于囊泡運動和鈣火花等快速的生理生化過程觀察。
3）低光毒性：得益于靈敏度的顯著提高，即使微弱的熒光，也可以收集到足夠的信號，因此激發光的強度和時間可以大幅度減少。光損傷和光淬滅不再是活細胞和微弱熒光觀察的障礙。
4）智能：焦點漂移和細胞脫離視野是活細胞觀察的夢魘。DeltaVision 特有的自動對焦（autofocus）和細胞跟蹤（cell tracking）功能，不僅可以自動維持焦平面的穩定，而且能夠跟蹤移動的細胞，使這些問題迎刃而解，長時間連續的活細胞觀察不再困難。

通過對熒光信號和細胞輪廓的識別，DeltaVision 可以精確的跟蹤需要觀察的細胞。
5）免維護：整個系統無易損易耗部件，光源壽命在 5000 小時以上，可正常使用7-10年以上，無需更換光源和校準光路。。系統控制和圖形處理基于Linux 操作系統，更適合多線程控制和數據處理，不僅大幅度降低了數據處理時間，也避免了在數據傳輸過程中感染病毒的危險。人性化的softWoRX軟件簡單易用，一個對話框內即可完成所有的控制操作。
三、API 高分辨活細胞成像系統的主要功能與應用領域
1）多維成像
目前可以做到六維（XYZ 三維，時間，不同點，不同波長）成像。通過光學切片（optical section）技術，實現對樣品的3D 觀察，構建樣品的立體結構。

經過3D 重建的腫瘤細胞：A 為正面，B 為旋轉30 度后，C 為旋轉90 度后。
2）3D 還原型反卷積處理
顯微鏡的分辨率和圖像的對比度取決于物鏡收集的光學信息。顯微鏡光路中衍射和折射現象的存在，使得樣品信號的位置和強度都發生了變化，降低了系統的分辨率和圖像的質量。API 作為對圖像數據進行反卷積處理最早的實踐者，將顯微鏡的硬件設計和后期軟件處理完美的結合在一起，通過對光學信號的3D 還原型反卷積處理，大大提高了顯微鏡的靈敏度和分辨率。

原始圖像和經過3D 反卷積處理后圖像的對比：A，B 為處理前，C，D 為處理后。
經過反卷積處理后，信號的強度和圖像對比度得到很大提升。
3）延時攝影
通過軟件精確的控制，拍攝的時間間隔從數秒到數小時不等，在長時間拍攝下也不會造成熒光信號的淬滅。根據實驗需求的不同，無論單一層面還是3 維結構，都可以獲得良好的效果。

正在分裂的Hela 細胞，其中綠色標記微管蛋白，紅色標記染色體
4）高速離子成像
結合高速 CCD 和高效的光路，在512×512 像素下仍然可以實現21 幀/秒的成像速度。對于快速的離子濃度的變化，最快可以50-100 幀/秒的速度獲取圖像。

細胞間鈣信號的傳遞。使用Fluo‐3 標記胞內的鈣離子，并給予熒光信號對鈣離子的強度進
5．熒光共定位分析
通過比較多個熒光通道的定位情況，即可知道他們在空間上和時間上的分布信息，進而得到相應的熒光信號是否存在相互作用、協同運動、定向運輸等。

體外重組的病毒顆粒侵染細胞，綠色標記病毒的殼蛋白，紅色標記病毒的RNA結合蛋白。病毒入侵前，由于病毒顆粒完整，綠色信號和紅色信號共定位。病毒入侵細胞后，脫掉表面的殼蛋白，綠色信號和紅色信號分離。
6）熒光共振能量轉移（FRET）
DeltaVision 特制的活細胞濾片組保證CFP/YFP，GFP/mcherry（RFP）熒光強度的精確記錄，并進一步計算出蛋白對之間精確的能量轉移系數。

計算不同熒光通道熒光信號的強度，進一步可得到能量轉移系數。
主要應用領域：
1）細胞遷移與細胞骨架；
2）細胞分裂與細胞周期；
3）細胞信號轉導；
4）組織分化與發育；
5）囊泡和蛋白運輸；
6）生理學和神經科學；
7）鈣離子信號研究；
8）蛋白質與DNA 的相互作用；
9）宿主與病原體相互作用；
10）癌癥研究；
11）藥理研究；
12）生物物理研究。