活細胞直接觀察實驗

實驗方法原理 培養的活細胞在一般顯微鏡下觀察時，細胞是透明的，反差很小，難以觀察到細胞清晰結構，只有應用附有相差裝置的顯微鏡，才能使目的物與背底反差增強，能夠看清細胞的輪廓和一些微細結構如線粒體、核仁、染色質等。

實驗材料 細胞

儀器、耗材 相差聚光器相差接物鏡

實驗步驟

一、相差裝置的使用

相差裝置或顯微鏡都由兩個主要部分組成：相差聚光器和相差接物鏡。

在每個相差接物鏡的光學系統中都有一個光環透鏡；在聚光器里有數個可轉換的相位板，一定倍數的接物鏡使用時需與相應的相位板一致。相差觀察時對照明要求嚴格，光軸要對正，視野照明光度應均勻。

1.  工作步驟

（1）先調好相位板，使聚光器相位板號與接物鏡放大倍數（相位板）相一致；

（2）然后抽出接目鏡，再換輔助望遠鏡，移動輔助鏡筒并調整聚光器相位板，使視野中兩個大小一樣的光環（如不同說明倍數不一致）必須相互吻合；

（3）再重新換上原接目鏡，即成相差圖像；當更換不同倍數接物鏡時，需按上述過程重新調節。

二、細胞

培養細胞生長在瓶底上，最適用倒置光相差顯微鏡觀察，而且需附有長焦距集光器，才能觀察厚度較大的培養瓶皿。

培養瓶壁厚度都＞20 μm，只限于用40×接物鏡，若用油浸鏡觀察細胞更微細的結構，需用支持物培養法；把細胞培養在長形蓋片上。

觀察時從瓶中取出制成臨時標本，其方法如下

1.  取一大型載物片，另取小塊優質濾紙剪成長方窗形，置于載物片上；

2.  用吸管向紙框中滴數滴培養液，使之充滿框內空間和浸濕紙框；

3.  把生長有細胞的蓋片擔在紙框中（令細胞面向上），再覆以大蓋片。

注意事項

一、相差裝置的使用

1.  對培養瓶、皿要求

相差顯微鏡觀察要求底物要平坦、質地均勻、透光度好；一般玻璃瓶凹突不平不適做相差觀察和攝影，用質地均勻的塑料培養瓶最好。

2.  準備

觀察和攝像前要擦凈培養瓶面，勿使殘留污跡影響透光度。

3.  調光

調整照明光的照明度和光軸，令視野照明均勻。對正光軸是顯微攝影的重要條件，忽視時不易獲理想效果。

4.  在無自控攝像裝置初次拍攝時，應把放大倍數、照明強度和曝光等條件一一記錄下來；做一組不同曝光時間的試驗，顯影后選最佳組合，作為以后再拍攝時的標準。

二、細胞

1.  觀察時液體不斷蒸發，應隨時從標本側方滴加營養液；但不宜過多以防液體漫過上方大蓋片，影響油浸觀察和攝影。

2.  本法只限短時間觀察細胞之用；在使用加溫載物臺對維持細胞功能更好，但能觀察2 小時左右，觀察時間過長，隨培養液蒸發、pH改變，細胞形態和機能狀態都將發生改變。