流式細胞儀和流式細胞術指南篇2

核酸插入染料

溴化乙錠(EtBr) 和碘化丙啶（PI）能夠結合到DNA雙螺旋的大溝。4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和Hoechst染料（有幾種常用的）則結合小溝。請注意， 一些染料 (例如碘化丙啶)也會結合到RNA發卡結構形成的溝中，因此如果要做DNA定量，需要用染料和RNA的混合液。其它染料，如7-AAD，不會與DNA大小 溝結合。

DNA 染料也用于細胞周期分析、染色體倍數分析和基因組大小量化。對于這些研究，通常會用到上面提到的DNA染料，但數據分析要求非常苛刻。幸運的是，有一篇很好的文章詳細概述了這一過程 [10]。

細胞凋亡測定就用到了流式細胞儀的多個特性。與DNA結合而不透細胞膜的染料可用于鑒定晚期凋亡和壞死細胞。識別細胞周期蛋白（聚合酶的裂解結構和磷酸化 組蛋白H3）的抗體都可以購買到。zui早的細胞凋亡標記是磷脂酰絲氨酸（PS）溢出，它通常只在細胞質膜內膜上存在。溢出被檢測到，卻并非用的抗體，而是通 過一個Ca2+依賴的結合蛋白，膜聯蛋白V（Annexin V）。這一分子可以購買到，通常連接幾種不同的熒光劑，它已經成為研究細胞凋亡的支柱。膜聯蛋白V的詳細分析請參見  [10]。

譜系染料，例如羧基二醋酸琥珀酰亞胺酯（CFSE）利用膜滲透結合蛋白，然后通過琥珀酰亞胺酯與鄰近蛋白作用。一旦被染色，細胞經過幾次分裂后仍然是染色狀態，因為跟細胞分裂消耗的時間相比，蛋白質的更新更緩慢。


陽離子和pH通道染料

鈣離子(Ca2+)用Fura-2和Indo-1染料檢測 [12]， 它們需要紫外線激發，因此許多流式細胞分析常用的染料在它們身上卻不能使用。Magnesium Green和 一些Fura-衍生物已經被成功用到檢測Mg2+上 [13]。其中有些是在可見光譜中激發的。對pH值測定的熒光染料從1979年就開始使用了。要收集實時數據，您的流式細胞儀要能顯示帶有時間軸的數據，收集率也必須在您想要測定的時候可以兼容多個樣品。

外排染料

幾種正常和轉化細胞能夠運輸有機化合物到細胞外。當細胞發生癌變時，這是極其重要的，從細胞中移除的分子可以作為化療藥物。然而，該轉運過程在正常細胞 中也能被發現，包括干細胞。一些外排的分子還具有熒光活性，有轉運活性的細胞外觀不同，當這些染料存在的時候，可通過流式細胞術分離。zui常用的染料是 Hoechst 33342，有轉運活性的細胞被稱為“側群細胞”[14]。

細胞器染料

標記細胞器的方法有三種。首先，可以用質粒載體轉染細胞，該載體上攜帶熒光蛋白基因，以及將蛋白質同特定細胞器分離的足夠肽段信息。第二，有結合細胞器的 抗體 - 特異性標志物，但它們需要細胞有通透性。染料往往使用簡單，穩定，熒光比多數熒光蛋白更明亮，一些可用于活細胞。Molecular Probes?提供多種染料，包括產品明細一個有用 。 一些常用的染料有：用于線粒體的紅色或綠色MitoTracker；用于氧化狀態線粒體的Dihydrorhodamine 123；LysoTracker Green和Lysosensor Green；用于內質網的DIOC染料，以及作用于高爾基的BODIPY染料。

數據分析-軟件

軟件使得圍繞數據分析的問題變得稍稍簡單了，這也是本文這一部分要討論的主題。然而，大多數軟件以zui適合硬件的方式來匹配特定儀器的操作和數據分析。在眾 多廠商里，根據收集的信息是模擬的還是數字的，數據有很大的差異。慶幸的是，有一些不錯的第三方軟件程序包，有一個甚至是免費的，并且他們幾乎不受儀器限 制，能夠開展多數想要的數據分析。

即使考慮到以上所列的困難，我們仍然不能將用這些儀器收集到的信息的廣度和深度細化為生物學或醫學的重要性的問題。在(  PubMed)搜索"flow cytometry" OR "FACS"的綜述文獻能找到許多這一話題的文章，其中這兩種方法中的一種或者兩種都有所使用。表I為通過這種方式找到的應用列表。

應使用流式細胞儀或細胞分揀儀自帶的軟件控制儀器，除非有令人信服的理由不要使用第三方軟件。通常這涉及到購買儀器制造商不再支持的用過的儀器。多數機器 特定的軟件允許進行一些分析。一臺雙激光臺式儀器可能沒有邊緣切割補償、標準化和統計軟件包。其次，有些軟件可能有大多數功能，但缺乏一個你需要的手稿或 演示文稿。第三，可能你的合作者有一臺不同的儀器，但你需要與他共享數據。zui后，你可能有數量有限的儀器軟件副本，但也有許多用戶想在他們自己的電腦上處 理數據，而不破壞原始數據。表III是主要的軟件套裝和它們應用的儀器。

首先，需要考慮儀器的類型。較舊的儀器，如BD FACS Calibur和FACScan，將數據處理為模擬信息。較新的儀器，如目前市場上大部分儀器，將數據處理為數字信息。模擬儀器輸出是一個FCS 2.x文件，它幾乎可以被任何分析軟件包讀取。數字數據可以導出為FCS 2.x或3.x文件，一些較舊的分析程序不能解析FCS3.0數據。一個例子是一個由Joe Trotter編寫的免費軟件包，可從 WinMDI下載。它可以在Windows 95和NT上運行，網上也有討論它可能可在XP上運行。也有一個為老式Macintosh計算機上運行SoftWindows編寫的In 80286版本。

不幸的是，即使兩臺儀器生成同樣的FCS 3.0數據，卻并不意味著人們可以自由地分享不同制造商儀器之間的數據。通常情況是文本格式的問題，可能有一些網上資源可以將一臺儀器特定格式的文件轉換 成另一臺儀器的。三個儀器獨立包可以自動或有小的應用程序為用戶這么做。

數字數據的優勢是什么？zui重要的是，每個數據點（細胞）包含相關數據，這樣，如果您將數據加載到分析軟件包，包括補償在內的幾乎所有參數可以修改。 FCS 2.x數據不能恢復為預補償條件，重新分析就受到限制了。

當然也有軟件包可以填補現有的分析或演示選項的缺口。其中有兩個例子，BD Biosciences的CytoPaint (  Leukobyte)和 Paint-A-Gate ，允許進行批處理聚類分析和展示/  另一個則是 Phoenix Flow Systems它在擴增和DNA分析的時候非常有用。

表3。現有的流式細胞儀軟件

目前，用于分析和數據共享好用的免費軟件包是Cytobank，上面展示了它的細胞分揀（FACSelect）功能。對那些打算研究信號轉導分子運行細 胞內流式分析的研究者來說，Cytobank能夠與他們進行數據共享，FACSelect就是其中一個例子。上傳的數據是保密的，可以將其標記為公開，或 只與特定的合作者共享。這樣，數據可以是限制的，完全不受限制的，或限制只向同行開放。Cytobank集成了所有必備工具：補償、限群、設置層次結構、 顯示事件子集表、創建等值線圖和熱圖、疊加直方圖。圖4是Cytobank數據的熱圖。

Cytobank確實提供了一個基于訂閱的高維數據集的功能。該軟件被稱為 "SPADE"。
 

圖 4. 典型的批量分析堆疊直方圖

     FlowJo是目前zui常用的流式細胞數據分析軟件包。程序安裝在個人電腦上，TreeStar可以跟隨目前數據分析和演示的趨勢。 FlowJo site提供了一個30天的試用版本10（蘋果版是9.6）。這本手冊有一個令人印象深刻的新功能列 表。不用說，建議在購買前先試用一下。圖5是批處理分析產生一系列層疊直方圖。流式細胞儀會快速生成大量數據。分析大量批處理樣品，然后以一種有意義的方式將它們展示出來是任何流式細胞分析軟件包的必備能力。
 

圖 5. DeNovo軟件得出的流式細胞分析結果

還有一個不錯的選項是DeNovo 軟件的FCS Express在線數據包。一位代表堆疊柱狀圖產生的一個批次analysisThe的替代方案，也是一個非常不錯的選擇，是在網上包FCS快速從頭軟 件。它也有一個令人印象深刻的功能列表，并且還產生了出版物 - Ready圖形。圖6示出了此分析軟件包的功率，并獲得的數據時，在接近瞬時的鈣的細胞內的波動。請注意，X軸是時間和更迅速的細胞訊問，更有意義的數 據。它也有一個令人印象深刻的新功能列 表，也生成直接用于發表的圖形。圖6展示了此分析軟件包的強大，對幾乎瞬時的細胞內鈣波動獲得的數據。請注意，X軸是時間，細胞檢測的越快，數據越有意義。

請注意，FCS Express已經適應了它們的圖像分析軟件，這一類型數據不斷涌現，因此如果一個人要從儀器上生成數據，必須留心，需匹配軟件的數據類型。

 

FCS從頭分析軟件  

       總結軟件部分，流式細胞儀會產生海量的數據。 導出的FCS標準數據能夠直接與不同儀器中的結果進行整合。儀器特異性的和儀器通用的分析軟件包給新用戶的是安全感的假象。要生成大量的數據并不難，但如 果我要試圖解釋這些數據，實驗的、收集的和分析的變量卻是無窮的。要學習如何選擇正確的試劑，適當的處理細胞，設置儀器優化您的應用程序，補償和運行恰 當的控制，闡明數據的意義，這些技能的獲得都需要耗費時間。除非你不打算運行四個以上的熒光染料并且所有的染色都是在細胞表面，跟有經驗的使用者緊 密合作，能避免所有自學者犯的常見錯誤。如果你打算做細胞分揀并希望zui后保留活細胞，這些是尤為重要的。

總結

       請看表I列出的30多種流式細胞的應用。找出zui接近您的研究興趣的一個，然后在PubMed 或谷歌學術上做快速的文獻檢索。確保"cytometry"為關鍵詞。留心在zui近的幾篇文章中數據的展示方式，了解試劑的數量，所用儀器的復雜性，以及數 據是如何被呈現出來的。然后回到本文中，看看我界定的新用戶和有經驗的用戶可能會面臨的所有潛在風險。對流式細胞儀的分析時間，試劑（和同種型對照，補償 珠，以及其他試劑和緩沖液）的成本做出估計。然后根據您的特定需要對其進行修訂，安排少數有經驗的使用者運行程序。這是我希望給那些剛進入該領域或者將要 開展從簡單分析到復雜多色實驗的使用者推薦的zui低限度的準備。