一、surface marker染色
1、收獲細胞,0.5-1x10e6/tube,用FACS Buffer 2ml洗滌一次,傾倒后濾紙吸干管口液體。
2、加入預先配置好的你需要染的surface marker的抗體混合液(即CD3,CD4,CD8抗體mixture),充分混勻,室溫下孵育20分鐘。
3、FACS Buffer 2 ml洗滌一次傾倒后濾紙吸干管口液體。
二、Intracellular Staining的步驟
1、加入Fix/permeabilizatioin Buffer(不同公司有各自的試劑,ebioscience或者BD,看你的抗體是那個公司的,但是操作流程大致相同)
2、加入Fix/Perm Buffer 250ul 后,混勻,4度孵育30分鐘(公司可能推薦1ml,我一直加250ul,絕對可行)或者室溫15~20分鐘
3、用公司配套的Perm Wash Buffer 1x的2ml洗滌1-2次,本人一直洗一次節約試劑,也沒有問題
4、如果有Isotype染色的,需要加Normal Rat Serum 4ul 進行blocking,混勻,室溫下孵育15分鐘
5、如果不做Isotype,第4步可以省略
6、不必洗滌,直接加入細胞因子抗體,室溫下孵育30-60分鐘,我建議是60分鐘,比30分鐘好,你也可以自己摸條件
7、最后再用1xPerm Wash Buffer 2ml洗一次,傾倒后,加入適量FACS Buffer就可以過流式了。
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