瓊脂糖凝膠電泳法
瓊脂糖凝膠具有較大的孔徑,因而適用于對較大分子的電泳分離,目前瓊脂糖電泳凝膠法已成為核糖核酸和脫氧核糖核酸檢測、分離和性質研究的標準手段。
核酸在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率取決于瓊脂糖濃度、核酸分子的大小以及核酸分子的形狀三個因素。一般來說,較低濃度的瓊脂糖凝膠適合于較大分子物質的電泳分離,其電泳速度與分子量大小有關,且分子量的對數值與電泳遷移率之間存在著線性關系,由此可以作為定量的基礎。其操作方法如下:
1 儀器裝置
電泳室及直流電源。常用的水平式電泳室即可,電源為穩壓直流電源,常壓電泳一般在100-500V,高壓電泳一般在500-10000V。
2 試劑
(1) 醋酸-鋰鹽緩沖液(pH3.0) 取冰醋酸50ml,加水800ml混合后,用氫氧化鋰調節到pH值至3.0,在加水至1000ml。
(2) 甲苯胺藍溶液 去甲苯胺藍0.1g,加水100ml使溶解。
3 操作法
(1) 制膠 取瓊脂糖約0.2g,加水10ml,置水浴中使溶脹完全,加溫熱的醋酸-鋰鹽緩沖溶液(pH3.0)10ml,混勻,趁熱將膠液涂布于大小適宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻板上,厚度約3mm,靜置,待凝膠結成無氣泡的均勻薄層,即得。
(2) 標準品溶液及供試品溶液的制備 按照各藥品項下制備。
(3) 點樣與電泳 在電泳槽內加入醋酸-鋰鹽緩沖溶液(pH3.0),將凝膠板置于電泳槽架上,經濾紙橋浸入緩沖液。于凝膠板負極端分別點樣1μl,立即接通電源,在電壓梯度約30V/cm、電流強度1-2mA/cm的條件下,電泳約20min,關閉電源。
(4) 染色與脫色 取下凝膠板,用甲苯胺藍溶液染色,用水洗去多余的染色液至背景無色為止。
在凝膠電泳中,首先應用的是瓊脂電泳,它具有以下優點。1瓊脂含液體量大,可達98%-99%,近似自由電泳,但是樣品擴散度比自由電泳小,對蛋白質吸附極微。2瓊脂作為支持體有均勻,區帶整齊,分辨率高,重復性好等優點。3電泳速率快。4透明而不吸收紫外線,可以直接用紫外檢測儀做定量測定。5區帶易染色,樣品易回收,有利于制備。然而瓊脂中有很多硫酸根,電滲作用大。瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的,是有半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖相互結合的鏈狀多糖。含硫酸根比瓊脂少,因而分離效果明顯提高。