fff簡介分子之間的能量轉移大多是由輻射導致的。然而當不同熒光物質非常靠近時（<10nm），會發生共振能量轉移（RET）。熒光共振能量轉移（FRET）是一種的型的 RET現象。
圖1 所示在 FRET 中，使用強光照射以激發供體能量，處于激發態的供體將一部分或全部能量轉移給
受體，受體被激發。如果受體熒光量子產率為零，則發生能量轉移熒光熄滅；如果受體也是一種熒光發射
體，則呈現出受體的熒光。光照下很多熒光物質會逐漸失去其熒光特性，這種現象被稱為光漂白。為了提高靈敏度，近期生物發光共振能量轉移（BRET）得到了廣泛應用1。BRET使用生物發光物質代替了熒光供體。由于BRET不在需要直射光線以激發供體，不存在放射性的能量轉移，所以避免了對樣品的損害（如圖2）。熒光素酶是一種螢火蟲體內的生物發光酶，被廣泛用于 BRET研究2。本實驗中，選擇Luc8（海腎熒光
素酶）作為供體（圖3），該物質由海腎（Renillareinformis）基因突變而來。如圖4所示，Luc8 的生物
熒光峰值接近480nm。
圖2：BRET示意圖
圖 3：海腎（左）和Luc8蛋白結構（右）
圖 4：Luc8的發射光譜右）
本實驗中，使用了四種類型的量子點（605、655、705和800）：它們具有高量子產率，并適用于多種熒光波長（圖5）。這些量子點在較大的波長范圍內都有吸收，但是在605、655、705和800nm時發出的熒光較強。
圖 5：量子點的結構（左）和熒光（右）
發光強度相對于強光直射產生的熒光強度較弱，同時使用微量比色皿獲得的光量較小。為了在測量 BRET時能夠更加地收集光，本實驗使用了發光微量池支架，該配件可zui大程度減少微量池與發射透鏡之間的距離（圖6）。
試劑和儀器
1.Lumina熒光分光光度計
2.發光微量池支架
3.PBS緩沖液0.1M（pH 7.4）
4.Luc8 150 M
5.量子點605、655、705、800 8 M（Invitrogen）
6.腔腸素H 1 g/ l 甲醇溶液（Promega）
7.NiCl2 100 M 蒸餾水溶液（Sigma Aldrich）
8.10 l 微量離心管
9.45 l 熒光微量池
10.吸液管和吸液頭
11.渦旋混合器
實驗步驟
1.準備4個10 l 微量離心管。
2.在每個離心管內填充94 l PBS 緩沖液和 1 l Luc8（供體）。
3.在每個離心管中添加5 l量子點605、655、705、800（受體）。
4.在每個離心管中注入2 l NiCl2溶液（供體和受體之間的結合試劑），并在充分混合。
5.將發光微量池支架安裝到Lumina上，注入樣品并插到支架上。
6.打開Luminous WaveScan 軟件，輸入設定參數，點51擊應用（Apply）（圖7）。
7.使用吸液管注入2 l腔腸素H，迅速合攏測試艙蓋，點擊開始按鈕。
8.應用基線校正功能對測得的光譜進行校正。單擊基線校正（Baseline Correction）圖標，使用具有zui低生物發光強度的波長進行基線校正（圖8）。
9.根據Luc8峰值對光譜進行標準化校正，比較量子點峰值。為了標準化，計算各個轉換標量，使得所有Luc8峰值強度相等。然后單擊標量計算器（Scalar Calculator）圖標，通過乘以轉換標量對其進行標準化轉換（圖9）。
儀器參數
圖 7：波長掃描測量條件
圖 8：基線校正窗口
實驗結果
從測得的光譜上，可以觀察到BRET現象，Luc8與各量子點發生了生物發光能量轉移（圖10）。由于多重量子點結合可在單個波長條件下產生多種波長，因此使用量子點的BRET對分子診斷和成像領域均有很大助。BRET 能量轉移的效率的因素有：（1）供體和受體之間的間隔距離；（2）供體發射和受體激發光譜的重疊。通過比較使用Luc8峰值進行標準化校正的光譜，我們可以證實量子點665-Luc8結合物在多個結合物中產生的BRET效率zui高。
實驗結論
Thermo Fisher公司的Lumina熒光分光光度計和發光微量池架配件有助于檢查BRET，其產生的噪音要小于FRET。此外，實驗證明根據量子點發射波長的不同，BRET現象可應用于較廣的波長范圍。