液相色譜串聯質譜法檢測食用油脂中苯并芘

苯并芘(Benzo(a)pyrene,BaP),又稱3,4-苯并芘,是一種含5個環的稠環芳烴,分子式為C20H12,結構如圖1所示。苯并芘常溫下是黃色結晶,幾乎不溶于水,可溶于苯、甲苯和環己烷,稍溶于乙醇和甲醇。苯并芘是最具有代表性的國際公認的強致癌物,可以通過呼吸、攝入和接觸等途徑進入人體,可損傷生殖系統,易導致皮膚癌、肺癌、上消化道腫瘤、動脈硬化和不育癥等疾病。苯并芘在自然界中廣泛分布,在油料加工和油脂生產中的不當操作以及苯并芘的親脂能力可能使其污染食用油。GB2716-2005《食用植物油衛生標準》規定食用油中苯并芘含量的最高上限為10μg/kg。目前,食用油脂中BaP的分析方法主要有紙(板)圖1苯并[a]芘的結構式色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法和氣相色譜-質譜聯用法。由于食用油成分復雜,其中苯并芘含量又極低,同時還存在著大量的干擾物質,因此無論使用哪種分析方法,都必須對樣品進行分離、富集等處理。在GB2716-2005中,苯并芘按GB/T5009.27《食品中苯并[a]芘的測定》方法進行測定,測定方法是熒光分光光度法和目測比色法。這兩種方法存在著操作復雜、溶劑毒性大、費時和準確度低等問題,以至于很難對油脂中苯并芘殘留進行有效的檢測。2008年,國家質檢總局頒布了GB/T22509-2008《動植物油脂苯并芘的測定反相高效液相色譜法》,該測定方法采用的是液相色譜熒光檢測方法,樣品經填充的氧化鋁柱子凈化之后,再濃縮、檢測。GB/T22509-2008測定方法的分析時間長、操作繁瑣、溶劑消耗比較大,不同操作人員的數據差異比較大。隨著分離和分析技術的發展,出現了商品化的固相萃取柱子,固相萃取與液相或者氣相色譜-質譜聯用技術已經應用于油脂中苯并芘的檢測。與傳統方法相比,固相萃取可以提高重復性、節約溶劑消耗,但是同樣操作比較繁瑣。因此,尋求并研究快速、準確的食用油中苯并芘檢測技術具有十分重要的意義。吳海智等人建立了高效液相色圖2在標準品(左)和樣品中(右)苯并芘及其內標氘代苯并芘的色譜圖譜法快速測定植物油中苯并芘的方法,油樣經稀釋、過濾以后直接進樣分析。這種方法前處理簡單,但是所需要的樣品量比較大(2.5g),靈敏度低,且采用外標法進行定量。而采用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)檢測油脂中苯并芘的方法還未見報道。本文采用LC-MS/MS建立了食用油中苯并芘的測定方法,利用內標法進行定量,并且與國標方法進行了比較。結果顯示:該方法靈敏、快速,適合于食用油中苯并芘的檢測。1試驗材料和方法1.1試驗材料苯并芘標準品(純度≥98%)、氘代苯并芘(d12-BaP,純度≥98%),購自美國Supelco公司;乙腈、四氫呋喃、甲苯均為色譜純,試驗中所用水是去離子水。1.2試驗儀器安捷倫1200液相色譜儀,配有G1329A自動進樣器、G131lA四元混合泵和G1316A柱溫箱,美國安捷倫公司;API5500三重四極桿串聯質譜儀,配有光電離離子源(APPI)和Analyst1.5軟件數據處理系統,美國應用生物系統公司;日立L-2130泵,日本日立高新技術公司;KQ-700DB型數控超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司。1.3分析方法1.3.1標準溶液的配制儲備液及工作液:用乙腈準確配制苯并芘(1g/L)和氘代苯并芘(1g/L)的一級單標儲備液,儲存于棕色玻璃瓶中,于-40℃下保存。分別準確量取一級單標儲備液苯并芘(1mL)和氘代苯并芘(1mL)于2個10mL棕色容量瓶,用乙腈定容至刻度,得到二級單標儲備液(100mg/L)。1.3.2樣品前處理樣品前處理參考先前報道的方法并做了適當的修改。即準確稱取1.00g(精確到0.01g)油樣于10mL容量瓶中,加入5mL四氫呋喃后,加入200μL的氘代苯并芘,然后用乙腈定容到10mL。放入超聲儀中超聲10min,然后過0.22μm的有機相濾膜,待測。1.3.3標準曲線繪制取7個10mL的容量瓶,依次加入2、5、10、20、50、100和300ng的苯并芘標準品,并且各加入200ng的氘代苯并芘,然后用乙腈定容至刻度,并且混勻,最終的濃度為0.2、0.5、1、2、5、10和30ng/mL(氘代苯并芘為20ng/mL)。按照1.4中的液相和質譜條件分析,以標準溶液濃度/內標的濃度為橫坐標,標準溶液峰面積/內標的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。1.3.4回收率和精密度試驗準確稱取已測定苯并芘含量的油脂1g,分別加入低、中、高3個濃度的苯并芘標準品,按照1.3.2的前處理方法處理樣品,并測定其苯并芘含量,每個水平重復5次,按下式計算回收率:回收率=(加入后樣品中的苯并芘含量-樣品中原來的BaP含量)/加入的苯并芘的量×100%選取低、中、高3個樣品,在同1d內測定其含量5次,計算其平均值和RSD。1.4色譜-質譜條件色譜條件:Dionex ACCLAIM C18色譜柱(150mm×3mm,3μm);流動相∶水,乙腈溶液;柱溫40℃;進樣量5μL。摻雜劑甲苯,流速為100μL/min;洗脫條件∶乙腈∶水,95∶5(V/V),流速為550μL/min,分析時間為8min。質譜條件:光電離離子源,多反應監測,正離子掃描方式;點噴霧電壓700V,霧化氣75psi,氣簾氣15psi,輔助加熱氣50psi,溫度600℃,射入電壓10V,碰撞能9eV;去簇電壓110V,駐留時間50ms。本試驗中所采用的定量離子對為253.2→252.1,定性離子對為253.2→251.1,內標的離子對為265.2→263.1。2結果和討論2.1色譜柱的選擇考察了不同柱子對于苯并芘的分離效果。其中XTerra MS C182.5μm2.1×50mm柱子出峰太早,對于苯并芘幾乎無保留;Aglent XDB-C183.5μm2.1×150mm即使乙腈比例達到100%,峰形也不是很好;ACQUITY U-PLC BEH C181.7μm2.1×100mm對于苯并芘的保留時間約為1.8min,但是由于實際樣品比較復雜,無法和干擾物得到有效的分離。因此,最終選擇Dionex ACCLAIMC18色譜柱(150×3mm,3μm),在1.4的色譜條件下,苯并芘和干擾物得到有效的分離如圖2所示,且保留時間比較合適,樣品中苯并芘的保留時間為4.03min,氘代苯并芘為3.85min。2.2超聲時間的選擇選取同一個樣本,按照1.3.2的前處理方法處理樣品,做6個平行,其超聲時間分別為10、15、20、30、40和60min,過濾膜以后測定其苯并芘的含量,結果發現:苯并芘的含量并不隨著超聲時間的延長而增加,因此最終選擇10min做為最佳的超聲時間。2.3標準曲線和檢測限苯并芘的標準曲線如圖3所示,利用內標法進行定量分析,在0.2～30ng/mL范圍內具有良好的線性關系。以信噪比(S/N)不低于3時的進樣濃度為檢測限(LOD),方法檢測限為0.1ng/mL;以信噪比(S/N)不低于10時的進樣濃度為定量限(LOD),方法定量限為0.3ng/mL。2.4回收率和精密度分別選取了0.5、5和20ng/mL3個添加水平做回收率,方法平均回收率范圍為89.8%～102%,RSD(相對標準偏差)在1.48%～2.59%,具體分析測定結果見表1。圖3苯并芘標準曲線表明方法對食用油分析具有良好的精密度和重復性。2.5方法對比利用建立的LC-MS/MS方法和GB/T22509-2008的方法對某品牌的食用植物油中苯并芘含量進行了測定,結果見表2。2個方法的相對標準偏差均小于5%,說明LC-MS/MS準確度良好,可以滿足油脂中苯并芘含量快速測定的要求。3結論本研究建立了一種食用油中苯并芘檢測的液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)方法。方法前處理簡單,重復性好,分析時間短,并且采用內標法進行定量,檢出限為0.1ng/mL,平均回收率范圍為89.8%～102%,能較好的滿足食用油中苯并芘的快速檢測需求。表1方法的回收率和精密度(n=5)樣本含量(ng/mL)加標量(ng/mL)檢測(ng/mL)平均回收率(%)相對標準偏差(%)0.150.500.6192.01.480.155.005.27102.01.580.1520.018.189.82.59表2LC-MS/MS方法和GB/T22509-2008方法測定結果比較序號GB/T22509-2008方法(μg/kg)LC-MS-MS方法(μg/kg)相對標準偏差(%)18.138.140210.39.74.2312.612.81.141514.23.953.944.082.5616.616.21.7液相色譜-串聯質譜法檢測食用油脂中苯并芘@劉玉蘭$河南工業大學糧油食品學院 @張小濤$河南工業大學糧油食品學院 @趙歡歡$河南工業大學糧油食品學院建立了一種食用油中苯并芘的液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)檢測方法。油脂經稀釋以后直接進入LC-MS/MS分析。方法線性范圍為0.2～30ng/mL,檢出限為0.1ng/mL,平均回收率范圍為89.8%～102%,RSD(相對標準偏差)在1.48%～2.59%。該方法能準確、快速和靈敏的檢測食用油中的BaP。