液相色譜（HPLC）入門（五）

正相高效液相色譜

在植物提取物的分離過程中，茨維特成功運用極性固定相[玻璃柱中的粉筆末； 如圖A]和弱極性[非極性]流動相。這種經典的色譜模式被稱為正相。

圖 S -1: 正相色譜法

圖 S -1 代表三個染料混合物的正相色譜分離。極性的固定相最強地保留了極性的黃色染料。相對非極性的藍色染料在非極性溶劑的流動相保留競爭中勝出，很快被洗脫出來。由于藍色染料最像流動相[兩者都是非極性]，它流動得更快。對硅膠柱正相色譜來說，典型的情況流動相是100% 有機相，不含水。

反相高效液相色譜

反相是指與正相恰好相反的色譜模式，即使用極性流動相和非極性[疏水性]固定相。圖 S-2 描述了三種染料的黑色混合物被該種方法分離的過程。

圖 S-2: 反相色譜法

現在最強保留的化合物是非極性較強的藍色染料，因為它與非極性的固定相吸附最強。極性的黃色染料，較弱保留，在極性水性流動相的競爭中勝出，流過填料床最快，最早被洗脫出來－－正是同性相吸。今天，由于其更好的重現性和更廣泛的應用，反相色譜占所有高效液相色譜方法的75%。大多數方法使用水和極性溶劑的混合物，如乙腈或甲醇。這樣一般來說能保證分析物與非極性，疏水性顆粒表面的適當相互作用。C18合硅膠[有時稱為ODS]是最普遍的反相高效液相色譜柱填料。圖 S-2: 反相色譜法[ 反相高效液相色譜 ]表C給出基于極性分離的兩種主要高效液相色譜的固定相和流動相特性的總結。記住，基于極性的模式，同性相吸。

表 C: 基于液相分離的兩相特性

親水作用色譜[HILIC]

親水作用色譜[HILIC]可以看作是正相色譜的一種變化。正相色譜中，流動相是百分之百有機相。只有痕量水分存在于流動相和極性填料的空隙里。極性分析物與極性固定相較強吸附，不會被洗脫下來。在有機流動相[典型的是具有質子惰性的溶劑，如乙腈]中加入一些水分[<20%]，就可能分離和洗脫在正相模式下強保留[或反相模式下弱保留]的極性化合物。水是強極性溶劑，和極性分析物有效競爭固定相。親水作用色譜HILIC 可以在等度或梯度洗脫模式下運行。隨著流動相極性[強度]的增加[加入更多水]，最初吸附在極性填料顆粒的極性化合物可以被洗脫下來。分析物按照親水性[相對水的色譜極性]由低至高的順序被洗脫出來。緩沖液或鹽可加至流動相中以保持離子化的分析物呈單一形式。

疏水作用色譜[HIC]

疏水作用色譜[HIC]是一種反相色譜用來分離大的生物分子，如蛋白。這些分子通常為保持原形而置于水溶液中，避免和會使其變性的有機溶劑或表面接觸。HIC 通過疏水性固定相來達到大分子疏水目的，例如，是C4硅膠柱而不是C18硅膠柱。起始階段，水中高鹽濃度將幫助填料保留[鹽析]蛋白。梯度分離經常是通過遞減鹽濃度來進行。這樣，生物分子按照疏水性由低到高被洗脫出來。

基于電荷的分離: 離子交換色譜[IEC]

基于極性的分離，同性相吸，異性相斥。基于電荷的離子交換色譜和其他分離方式，規則是相反的，同性相斥，異性相吸。離子交換分離的固定相以表面酸堿性強弱和吸附保留的離子類型來劃分。陽離子交換是用負電荷表面來保留和分離帶正電荷的離子。反之亦然，陰離子交換是用正電荷表面來保留和分離帶負電荷的離子[如圖 T ]。每一種離子交換類型，都至少有兩種分離和洗脫方法。

圖 T: 離子交換色譜法

強離子交換體系具有易離子化的官能團[即，季胺類或磺酸類]。它們主要用于保留和分離弱離子。這些弱離子可被含有可更強吸附在固定相表面的離子的流動相洗脫或代替。或者，弱離子可以被保留在柱上，之后通過原位改變流動相的pH值被中和，使其失去吸附力而被洗脫。弱離子交換體系[如，二胺類或羧酸類]可能在某個pH值以上或以下被中和而失去保留帶電離子的能力。當攜帶電荷時，它們用來保留和分離強離子。如果這些離子不能被替代物洗脫，固定相交換點可能被中和而切斷離子化吸附，使得帶電分析物被洗脫下來。

表 D: 離子交換綱要

當弱離子交換體系被中和，它們可以通過疏水性[反相]或親水性[正相]相互作用保留和分離化合物； 在這樣的情況下，洗脫強度由流動相的極性來決定[圖 R -1]。因此，弱離子交換體系可用于混合分離模式[同時基于極性和電荷的分離]。表 D 列出離子交換的主要分類綱要。例如，保留強堿性分析物[總是帶正電荷]，在pH值大于 7 時使用弱陽離子-交換固定相顆粒，可以產生陰離子顆粒表面。為了釋放或洗脫強堿物質，降低流動相 pH 值至 3 以下； 可以去除表面電荷，切斷離子交換保留機理。pKa 值是 50% 的官能團被離子化，50% 的官能團為中性時的 pH 值。為保證完全中性，或完全帶電，分析物或顆粒表面pH值必須調整到比 pKa 值高兩個數量級才合適[如表 D 所示]。不要使用強-陽離子交換體系保留強堿物質； 兩者都帶電荷并強烈地相互吸引，使得堿性物質幾乎無法洗脫出來。只能用更強保留的競爭型堿物質來沖洗這個強陽離子交換體系，贏回活性交換位點，替換目標化合物。這種做法在高效液相色譜和固相萃取 SPE 幾乎沒有實用性，也不安全。[強酸和強堿在操作中很危險，可能對高效液相色譜流路材料具有腐蝕性] 。

基于尺寸大小的分離

排阻色譜[SEC] - 凝膠滲透色譜[GPC]十九世紀五十年代，Porath 和 Flodin發現生物分子可以通過過濾或流經孔徑可控的親水右旋糖苷聚合物時按照大小被分開，而不是基于電荷數或極性。這個過程被稱為凝膠過濾。后來，一種類似的裝置，使用特定孔徑范圍的有機聚合物填料可分離合成寡聚物和多聚物。這個過程成為凝膠滲透色譜[GPC]。使用孔徑可控的硅膠填料操作類似的分離過程被稱作排阻色譜[SEC]。世界上第一臺用于 GPC 的商業化高效液相色譜儀出現在 1963 年。

總結

所有這些技術通常是通過固定相來實現。這些固定相為使得感興趣的分析物進入或不能進入孔內而被合成為一定孔徑分布的填料。小分子在通過填料床時更多地進入到顆粒孔隙中。大分子只能進入某一尺寸以上的孔隙，所以在填料床停留的時間較短。最大的分子可能完全不能進入孔內而只在顆粒間通過，因此被小體積流動相很快洗脫出來。選擇流動相有兩個理由：第一，對被分析物來說是良好的溶劑；第二，可以防止被分析物和固定相表面的相互作用[基于極性或電荷]。這樣，大分子先洗脫出來，小分子流動慢[因為它們流進更多的孔內再流出]而后洗脫出來，按照在溶液中的尺寸由高至低的順序。因此，簡單的規則：大的先出來。

由于可以將聚合物的分子量和溶液中的大小相關聯，即 GPC 革命性地實現聚合物分子量分布的測量，那樣就可以決定聚合物物理特征，從而可提升或減少聚合物生產工藝，質量和性能[如何分辨好的和差的聚合物]。