液質聯用中的數據采集和分析

　　質譜儀器的主要控制系統包括電源控制、同步與時序控制、數據采集三大部分，三大部分的整合則是通過控制軟件來達成，本文不再詳述。下面主要介紹一些常見術語和一些特殊的方法。

　　1、質譜圖

　　質譜圖的X軸代表質荷比，Y軸代表離子峰的相對強度或以離子數目呈現。原始質譜圖稱作輪廓譜圖（Profile Spectrum），用各離子峰的重心點（Centroid）來表示的譜圖稱作棒狀圖。

　　2、離子流色譜圖

　　各組分從色譜流出后進入質譜進行分析。以保留時間為橫坐標，然后以離子強度為縱坐標，繪制譜圖。此處的離子強度指的是所有離子或特定范圍內離子強度的和，即在質譜內進行掃描時，每次掃描都會產生一張質譜圖，將每一張質譜圖中所有離子強度相加，得到一個總的離子流強度圖，稱為總離子流色譜圖（Total Ion Chromatogram，TIC），如果是提取某種特定化合物的離子峰圖，稱為提取流色譜圖（Extracted Ion Chromatogram，XIC）；相應時間下出現的豐度最強的離子峰圖稱為基峰色譜圖（Based peak Chromatogram，BPC）。

總離子流色譜圖TIC和提取流色譜圖XIC

　　3、整數質量、精確質量、單一同位素質量

　　根據IUPAC，碳原子質量被定為12.00000 amu，因此其它原子和分子的質量都是非整數值。低分辨質譜的質量分辨率及精密度不夠，通常只能觀測到整數質量（Nominal Mass），提高分辨率后，可以觀測到非整數質量的信息。

　　一般而言，質量分辨率>10000的質譜儀，可以提供小數點后四位的質量，這種質量信息稱作精確質量（Accurate Mass），可據此提供元素組成的信息，對于化合物的鑒定有很大幫助。

　　4、質量分辨率和質量準確度

　　質量分辨率（Resolution，R）是指分開兩個峰的能力，剛剛分開時兩峰之間的質量距離是ΔM，R＝M/ΔM，M可理解為兩個剛剛分開的峰的平均質量。 最嚴格的分辨率定義是磁質譜的，要求相鄰兩峰10％峰谷分開才算真正分開。而液質聯用中的各類質譜分辨率的定義是要求50％峰谷剛剛分開就算分開。因為實際工作中很難找到恰好在50％峰谷分開的峰，所以又簡化為用單峰法表示，即測定一個峰的半峰高處的全峰寬Full width half Maximum（簡寫為FWHM），FWHM應近似等于ΔM。單位質量分辨率一般認為FWHM＝為0.5或0.7。

　　質量準確度的定義為實驗測量質量（Mexperimental）與理論計算質量（Mtheoretical）的質量誤差（Mass Error），它表達為Mass Error/Mtheoretical，此值通常乘以10⁶，以ppm表示。

　　5、靈敏度、檢測限與校準曲線

　　靈敏度常用信噪比（S/N）表示，計算方法有兩種：均方根（RMS），峰峰比（S/N）。 均方根（RMS）計算方法信噪比最高，峰峰比方法信噪比最低。比如，液質聯用常用進樣1pg利血平的信噪比作為儀器驗收的指標。為了進一步體現高靈敏度，有時驗收時用fg級痕量物質測定檢測限（S/N>3）。

　　在定量分析時，分析物產生的信號需在儀器的動態范圍（Dynamic Range）內，動態范圍定義為信號與含量成正比的范圍，這樣才能利用校準曲線準確地確定分析物的含量。

　　最低可產生線性信號的分析物濃度或質量稱為定量限（Limit of Quantitation，LOQ），一般用S/N>10來定義。最高可產生線性信號的分析物含量稱為線性限（Limit of Linearity，LOL），當分析物產生的信號超過LOL時，由于檢測器過飽和，觀察到的信號將會比預期是線性關系所產生的信號低。

　　6、多電荷譜圖分析

　　大分子（如蛋白質、多肽）在酸性溶液中分析，其電噴霧電離會形成帶有多個正電荷的譜圖，可以應用價態去卷積（Charge Deconvolution）來獲得其分子量。一般會使用相應的軟件，其基本原理為先計算價態，再計算分子量。

ESI電離后胰蛋白酶的多電荷譜圖

　　除去卷積方法外，高分辨質譜圖對大分子質量的判定，也可由其同位素峰間的差距計算出該分子峰的離子電荷數，進而獲得其分子質量。

　　7、使用質譜進行定量的分析方法

　　用液質聯用選擇特征離子進行定量分析是必要的，在高分辨質譜中，可以使用更窄的質荷比范圍收集分析物信號定量分析，來降低樣品中相似質荷比的基質信號干擾。在低分辨（單位質量分辨）質譜中，必須使用分析物質荷比±0.5 Th的范圍內所得到的信號進行定量（質荷比選擇寬度1 Th），此外用串聯質譜的MRM或PRM也會大幅降低干擾提升專一性；用對分析物更有利的電離方法，選用合適的前處理方法，也能提升定量的專一性。

　　外標法

　　指使用不同濃度的分析物標準品，得到不同分析物信號進行校準曲線繪制，再使用校準曲線所得到的分析物濃度與信號的回歸線計算樣品中分析物的濃度。由于基質的影響，必須將不同濃度的標準品配制在接近于樣品基質的溶液中，來建立校準曲線。要注意的是，基質溶液必須不能含有分析物，因此并不是每種分析法都適合進行外標定量法。此外，制作校準曲線需在動態范圍內至少有4~5個不同濃度的數據點，建好后需以不同于校準曲線制備標準品來源的標準品來確認校準曲線的適用性，其濃度最好是校準曲線的中間點，而且必須定期以標準品核查。

　　標準加入法

　　當無法得到代表樣品基質的溶液時，可利用標準加入法（Standard Addition Method）進行定量分析。標準加入法為直接加入不同量的分析物標準品到樣品中并建立標準曲線。標準加入法所建立的標準曲線由于直接是在樣品中建立，因此校準曲線的斜率與真實樣品最相近，標準加入法所建立的校準曲線其外延至樣品含量的軸為負值的濃度即為樣品內分析物的真實濃度。此方法必須將樣品分成多個等份，并加入不同量的標準品進行校準曲線繪制，由于每個樣品均制作標準曲線，因此樣品需要較多且分析時間也相對較長。

利用標準加入法定量

　　同位素內標法

　　質譜使用同位素內標法定量的最大好處是可以使用與待分析物結構完全相同的穩定同位素標準品進行分析，可以消除分析過程的誤差，并可在質譜分析時因其與待分析物質量的差異，將標準品與待分析物信號完全分離，不會互相干擾。

　　在樣品前處理以及分析過程中就先加入同位素內標物，可消除樣品在處理以及分析時回收率、基質效應以及質譜分析時因離子化或是電子元件不穩定造成的定量誤差。由于同位素內標濃度是已知的，可以根據信號響應的比值準確計算出分析物的濃度。

　　同位素標定定量法

　　當無法取得分析物的同位素標準品時，可以利用結構相同但同位素組成不同的衍生化試劑。如分析物和輕試劑反應，標準品與重試劑反應，將反應后的標準品加入反應后的樣品溶液，則可進行如前所述的同位素內標定量。

　　同位素標定定量法也可進行樣品間的相對定量，常用于蛋白質組學分析，主要包括質量差異標記和同整質量標記（Isobaric Tag）兩種方法。前者代表方法為ICAT定量，后者代表方法為iTRAQ和TMT定量，它們都屬于化學標記，也是蛋白質組學重最常用的定量方法。

　　化學標記法

　　Gygi等發展了同位素編碼親和標簽（Isotope-Coded Affinity Tag，ICAT）。此試劑包含了可鍵合于半胱氨酸（Cysteine）的反應基團（Reaction Group），含不同同位素的定量標記鏈接（Linker）和含有生物素（Biotin）可做純化的親和基（Affinity Group）。此試劑定量標記鏈接上共有8個氫原子，輕的氫、重的氘同位素將造成具有8 Da質量差異的多肽對。

　　 ICAT定量時，兩種細胞萃取出的蛋白質被標示不同同位素組成但結構相同的化學標記，水解后再利用Avidin（親和素）將標記上的多肽純化出來并進行質譜分析。經過串聯質譜分析可鑒定多肽的序列以及所對應的蛋白質種類，在一級質譜上觀察到每個多肽受到輕重同位素標記產生固定質量差距的信號對，此信號對可用來得到相同蛋白在不同細胞狀態的相對表達量（Relative Expression）。

使用ICAT對蛋白質樣品進行定性與定量分析

　　早期ICAT試劑有一些缺點，如標簽分子量較大，結合多肽后也會產生CID解離碎片，使譜圖變得復雜；其次試劑使用8個氫原子來做質量標簽，會引起同位素效應，即輕或重標簽標記的多肽在HPLC分離時，多肽對的色譜保留時間的不同造成定量上的誤差。后來AB公司發展出第二代cICAT（Cleavable ICAT）試劑，它以可酸解的標記端來連接同位素標簽和生物素，其基本實驗流程與第一代相同，差異是在進行質譜分析前，必須先經過酸切的步驟，以分離生物素及被標定的多肽。這種同位素標簽由碳原子（12C和13C）組成，在分子量上的差異相對較小，所以被12C和13C標記的多肽在HPLC分離時具有相同的保留時間，可降低同位素效應，增加定量準確性。

　　后來，AB和賽默飛公司又分別推出iTRAQ（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation）和TMT（Tandem Mass Tags）試劑，主要用串聯質譜完成定量，也是目前最常用的蛋白質組定量方法。它們包括4種~16種同位素的編碼標簽，可同時比較多個樣品中蛋白質的相對含量或絕對含量。

　　以iTRAQ四重標簽試劑為例，它由3個化學基團組成，分別是反應基團、報告基團和平衡基團。反應基團特異與肽段的氨基（肽段的 N 端、賴氨酸的氨基）發生結合反應， 報告基團的質量數不同，分別為114、115、116、117，加上相應的平衡基團（分別為31、30、29、28）后，保持 iTRAQ 試劑總的質量數均為145 Da，因此稱為同整資料標記（Isobaric Tag），同時保證不同標記的肽段在色譜中的保留時間相同。

　　由于是等質量的，被不同標記的肽段在一級圖譜中表現為一個母離子峰，進一步碎裂時，平衡基團發生中性丟失，報告基團則會產生相應的不同質量數的報告離子，比較報告離子的豐度值，可以得到樣本的相對豐度比。目前 iTRAQ 可以同時對 4 個或者 8 個樣本進行標記與定量。

iTRAQ 8標簽試劑定量流程

　　賽默飛的TMT原理類似，TMT試劑最多可采用11種穩定同位素標簽，包括2-plex、6-plex、10-plex、11-plex，TMT Pro試劑包括16-plex、18-plex。根據反應化學，TMT試劑分為三類——胺反應性、半胱氨酸反應性和羰基反應性。

TMT pro 18-plex標簽試劑定量流程

　　TMT試劑的結構設計。TMT試劑結構的功能區域包括高能碰撞解離（HCD）和電子轉移解離（ETD）和CID（碰撞誘導解離）的MS/MS碎裂位點。胺反應性、半胱氨酸反應性和羰基反應性TMT試劑如（A）、（B）和（C）所示。

TMT試劑的結構設計

　　細胞培養中的氨基酸穩定同位素標記（Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture，SILAC）

　　SILAC是一種代謝標記法，可對體外培養細胞或細菌進行代謝標記，但尚難用以人類蛋白質組。其實驗原理是：在細胞培養基中加入輕、中或重型穩定同位素標記的必需氨基酸（賴氨酸和精氨酸），通過細胞的正常代謝，使新合成的蛋白帶上穩定同位素標簽。然后等量混合各類型蛋白質，酶解后進行質譜分析。通過比較一級質譜圖中同位素峰型的面積大小進行相對定量，同時二級譜圖對肽段進行序列測定從而進行蛋白鑒定。該方法在實驗早期就進行同位素標記，定量較為準確，但缺點是只能限定于細胞標記，無法應用于組織或體液。

SILAC定量法示意圖

　　免標記定量法（Label-Free）

　　基于質譜標記定量蛋白質組學應用范圍比較廣泛，美中不足標記試劑成本和樣本制備較為復雜，復雜樣本中處理的重復精度受限。直接通過MS信號進行定量的技術（Label-Free Quantification，LFQ）就很好地解決了這個問題，Label-Free技術不需要昂貴的標記試劑，基本適合各種類型樣本進行定量，也廣泛應用于定量蛋白質組學的研究。當然，它沒有穩定同位素標記法準確。

　　基于質譜無標記定量的蛋白質組學按照定量原理基本上可以分為兩大類：一類是基于離子流色譜峰（Extracted Ion Current，XIC）定量的信號強度法，第二類是基于譜圖計數法（Spectral Counting，SC）進行蛋白峰度的相對定量。

　　由于概念簡單、周期快，譜圖計數法吸引了很多關注，但低含量的蛋白質取得的MS/MS譜圖數量少，定量準確性較差，譜圖計數法比較適合于濃度高的蛋白質。

　　信號強度法能夠更準確估計蛋白質的濃度差異，且不受串聯質譜圖總數的影響，但需要高分辨質譜來分辨質量相近的多肽，此外，數據處理流程相對復雜，計算速度慢。

總結

    在所有的分析手段中，質譜具有“3S+3A”的所有特征：高靈敏度Sensitivity、高選擇性Selectivity、高速度Speed、高準確度Accuracy、可自動化Automation、廣泛的可用性Application。分析檢測手段，但凡滿足“3S+3A”中的1-2條，就有存在的價值，而質譜是六項全能。質譜的通用性更是出類拔萃，宏觀上我們知道所有物體的質量都可以用“秤”來稱量，這要感謝牛頓祖師爺發現的萬有引力。而在微觀上測量各種粒子的質量，就要依靠質譜，質譜又被譽為“測量分子和原子的秤”。但質譜不僅僅是一臺簡單的“秤”，它可驅動帶電離子飛行并將它們分離，所以用“飛揚的離子”來形容質譜也很有詩意。

    本文介紹了質譜中重要的液質聯用技術，主要用于食品、環境、藥物、生命科學、臨床等領域。由于軟電離的特性，一級質譜往往只有干凈的分子離子峰，但由于各種形式串聯質譜的出現，液質聯用的各級譜圖中呈現出豐富的結構信息，并可以用以結構鑒定、確證和定量。因此，質譜是讓很多人癡迷的技術，它變幻無窮的技術組合，賦予人們探索未知世界的想象力，也交給人們定量已知物質的一把利刃。圍繞質譜的創新永不停歇，新的離子源、新的質量分析器、新的數據算法不斷出現，它們產生的一系列組合又打開了一扇扇應用之門，指引著人們更興奮地探索新的方向（完）。