液質聯用技術分析延胡索中的生物堿類成分

液質聯用技術分析延胡索中的生物堿類成分

　　延胡索又稱元胡，為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang的干燥塊莖，具有活血、利氣、止痛之功效，臨床用于治療胸脅、脘腹疼痛、經閉痛經、產后瘀阻、跌撲腫痛等癥[1]。延胡索的主要成分是生物堿，其類型分屬原小檗堿型、原托品堿型、阿樸菲型、苯并菲啶型等四種異喹啉類生物堿，其中多數屬原小檗堿型，少數為阿樸菲型與原托品堿型[2~5]。通過高效液相色譜法（HPLC）對其中的一種或多種生物堿進行分析，可以確定延胡索中主要組分并測定其含量[6，7]，但該法對化合物的定性能力很有限，必須在有標準對照品的情況下才能進行保留時間的比對定性和定量分析，據此所建立的延胡索質量控制方法大多只針對延胡索乙素等少數生物堿，不夠全面。液質聯用技術(HPLC-MS)是目前廣泛應用的分析方法之一，它利用液相色譜的高效分離能力對被分析樣品進行分離，再以質譜為檢測器在線提供化合物的分子量信息，特別是電噴霧(ESI)軟電離質譜技術的出現，為研究熱不穩定和極性較大的化合物提供了簡捷快速的分析方法，而多級串聯質譜技術還可以提供被分析成分的結構信息。有些微量、痕量成分和無紫外吸收的化合物在用HPLC分析時很可能被忽略，而MS具有高度的靈敏性，可檢測到皮克級物質，因此很容易發現這些化合物的存在[8]。目前，HPLC-ESI-MS技術已被廣泛用于植物有效成分的分離及結構鑒定中[8]。此實驗采用HPLC-MS聯用技術分析了延胡索中的主要季銨堿類和叔銨堿類成分。 
　　1儀器與試藥 
　　1.1 儀器 
　　Agilent 1100 HPLC-DAD高效液相色譜儀，Waters SunFire ODS-C18柱，英國Micromass LC/TOFMS (飛行時間質譜儀)。 
　　1.2 藥材與試劑 
　　延胡索（浙江松陽產，經南京中醫藥大學劉漢清教授鑒定為Corydalis yanhusuo W. T. Wang 的干燥塊莖）；延胡索乙素（中國藥品生物制品檢定所，批號0726-200510）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。 
　　2 方法與結果 
　　2.1 樣品(YHS）制備 
　　取延胡索100 g，粉碎，加1 000 ml純凈水回流提取1 h，水提液減壓回收至80 ml，量取此濃縮液1 ml，加入1 ml甲醇，混勻，離心，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，制得待測樣品。 
　　2.2 儀器條件 
　　2.2.1 液相色譜條件 ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A為5%冰醋酸水溶液，B為乙腈；流速0.8 ml/min；采用線性梯度洗脫，梯度洗脫程序為0~10 min B為10%，10~35 min B為10%~20%，35~60 min B為20%~44%，60~85 min B為44%~80%，85~90 min B為80%~95%，90~100 min B為95%；進樣量為10 μl。 
　　2.2.2 電噴霧質譜條件ESI離子源，正離子檢測模式；Capillary 3 000 V；Sample cone 50 V；Extraction cone 3 V；RF lens 300 V；Desoluation Temp 110℃；Source Temp 90℃；MCP Detector 2 670 V。 
　　2.3 實驗結果 
　　延胡索水提取物（YHS）的HPLC-UV圖譜和HPLC-MS總離子流圖如圖1所示，兩者的峰形和峰與峰之間的分離度都較好。根據MS所測定的[M+H]＋值，通過檢索文獻[2~5]，鑒定出了YHS中的11個化學成分，分別為四氫非洲防己堿、原托品堿、延胡索堿、黃連堿、延胡索乙素、非洲防己堿、四氫黃連堿、四氫小檗堿、小檗堿、巴馬亭、脫氫紫堇堿，見表1。為了確證以上推論，本研究做了延胡索乙素的HPLC-MS的研究，HPLC和MS的條件即用分析YHS的條件，結果延胡索乙素在HPLC中的保留時間為27.915 min，[M+H]＋值為356，與YHS中的第5號成分相符，所以可以判斷第5號成分為延胡索乙素。 
　　 
　　3 討論 
　　電噴霧(ESI)質譜是一種“軟電離”質譜，碎片離子很少。延胡索中叔、季銨生物堿電離出的分子離子峰主要以[M+H]＋的形式存在，在質譜中可得到很好的響應。由于除延胡索乙素外，其他成分沒有對照品，還不能充分斷定這些成分的化學結構，所以還需對這些成分的分子離子峰做二級或多級電離質譜，獲取更多的碎片離子峰信息，再根據延胡索中各種生物堿的裂解規率，最終確定其化學結構。 
　　本實驗利用HPLC的高分離性能和ESI-TOF/MS的強大定性功能，建立了一種快速分析延胡索水提物中各種主要生物堿的方法，為延胡索的質量控制提供了可行依據。