實驗方法原理 1975年，Kohler和Milstein發現將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產生抗體，又可無限增殖，從而創立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術上的突破不僅為醫學與生物學基礎研究開創了新紀元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。
制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產，要經過幾個月的一系列實驗步驟。
實驗材料 小鼠骨髓瘤細胞
試劑、試劑盒 NCS
儀器、耗材 CO2孵箱培養板
實驗步驟
一、細胞融合前準備
1. 免疫方案
選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。
（1）顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案
初次免疫 1×107/0.5 ml ip （腹腔內注射）
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×107/0.5 ml ip
↓ 3周后
加強免疫（融合前三天）1×107/0.5 ml ip或iv（靜脈內注射）
↓
取脾融合
（2）可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
初次免疫 Ag 1～50 μg 加福氏完全佐劑皮下多點注射（一般0.8～1 ml 0.2 ml/點）
↓3周后
第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（ip劑量不宜超過0.5 ml）
↓3周后
第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip（5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果）
↓2～3周后
加強免疫，劑量50～500 μg為宜，ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如
①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接采用脾內注射。
③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，促進免疫細胞對抗原反應性。
2. 飼養細胞
在制備單克隆抗體過程中，許多環節需要加飼養細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射后作為飼養細胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存，隨用隨復蘇。
小鼠腹腔巨噬細胞的制備
小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6～10 周齡
↓
拉頸處死，浸泡于75 ％酒精，消毒3～5 分鐘
↓
用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
↓
用無菌注射器注入6～8 ml培養液
↓
反復沖洗，吸出沖洗液
↓
放入10 ml離心管，1200 轉/分離心5～6 分鐘
↓
用20 ％小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸，調整細胞數1×105 /ml
↓
加入96孔板，100 μl/孔
↓
放入37 ℃，CO2孵箱培養
一般飼養細胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106 腹腔巨噬細胞，若用小鼠胸腺細胞作為飼養細胞時，細胞濃度為5×106 /ml，小鼠脾細胞為1×106 /ml，小鼠的成纖維細胞（3T3）1×105 /ml，均為100 μl/孔。
3. 骨髓瘤細胞
骨髓瘤細胞系應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內產生大量McAb。
常用骨髓瘤細胞系有：NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤細胞的培養適合于一般的培養液，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10～20 ％，細胞的最大密度不得超106 /ml，一般擴大培養以1∶10稀釋傳代，每3～5 天傳代一次。細胞的倍增時間為16～20 小時，上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。
一般在準備融合前的兩周就應開始復蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的敏感性，每3～6月應用8～AG（8氮雜鳥嘌呤）篩選一次，以防止細胞的突變。
保證骨髓瘤細胞處于對數生長期，良好的形態，活細胞計數高于95 ％，也是決定細胞融合的關鍵。
4. 免疫脾細胞
免疫脾細胞指的是處于免疫狀態脾臟中B淋巴母細胞和漿母細胞。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。
脾細胞懸液的制備
在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培養液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網上，用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的2倍，細胞數為2×108左右。
二、細胞融合，選擇雜交瘤
1. 細胞融合流程
（1）取對數生長的骨髓瘤細胞SP2/0，1000 rpm離心5 分鐘，棄上清，用不完全培養液混懸細胞后計數，取所需的細胞數，用不完全培養液洗滌2 次。
（2）同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養液洗滌2 次。
（3）將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50 ml塑料離心管內不完全培養液洗1 次，1200 rpm，8分鐘。
（4）棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
（5）輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動。
（6）在室溫下融合
①30 秒內加入預熱的1 ml45 ％PEG（Merek，分子量4000）含5 ％DMSO，邊加邊攪拌。
②作用90 秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120 秒鐘。
③加預熱的不完全培養液，終止PEG作用，每隔2 分鐘分別加入1 ml，2 ml，3 ml，4 ml，5 ml和10 ml。
（7）離心，800 rpm，6 分鐘。
（8）棄上清，先用6 ml左右20 ％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。
（9）根據所用96孔培養板的數量，補加完全培養液，10 ml一塊96孔板。
（10）將融合后細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔板，100 μl/孔，37 ℃、5 ％CO2孵箱培養。
一般一塊96孔板含有1×107脾細胞。