深圳先進院團隊開發出新型熒光探針

論文截圖

9月12日，中國科學院深圳先進技術研究院醫工所生物醫學光學與分子影像研究中心儲軍課題組的最新成果發表于《自然—通訊》。研究人員研發了在活細胞內具有12倍熒光變化的高性能基因編碼的cAMP綠色熒光探針(命名為G-Flamp1)。該研究結合顯微成像和光纖記錄等技術，實時高靈敏監測了果蠅和小鼠等模式生物在特定行為過程中特定神經元的cAMP信號時空動力學變化，探索了cAMP動力學與動物行為之間的內在關聯。

Nature Methods的審稿人在審稿過程中對該成果給予了高度評價，認為G-Flamp1探針具有非常棒的性質，在熒光探針的性能上具有很大的提升，該探針打開了很多有趣的cAMP信號研究的大門，是非常及時和高質量的研究成果。

深圳先進院儲軍研究員為該論文的通訊作者，深圳先進院助理研究員王亮博士及北京大學鄔春靈博士為該論文的共同第一作者。

細胞是包括人類在內的絕大部分生命體結構和功能的基本單位。細胞不斷地接受周圍環境的信號，并將其轉變為細胞內相應分子（如蛋白質、有機小分子、離子、DNA和RNA等）的數量、分布和活性狀態的變化，從而改變細胞的形態和生物學功能等。該過程的異常則與疾病的發生發展相關。因此，科學家們往往通過檢測上述關鍵分子的時空變化來理解細胞的功能，并闡明相關疾病的發生機制。

在該研究中，研究人員選取細胞內重要的第二信使分子環磷酸腺苷(cAMP)作為研究目標。cAMP可傳遞細胞表面多種G蛋白偶聯受體（GPCR）的信息，在學習與記憶、藥物成癮、運動控制、免疫、腫瘤、代謝等過程中發揮重要作用。

“活細胞和活體水平的cAMP分子濃度變化的高時空分辨率熒光成像是解析cAMP信號通路及其生物學功能的重要基礎。因此，開發高靈敏的cAMP熒光探針成為研究復雜生物過程的關鍵。”論文通訊作者儲軍研究員表示。

與非基因編碼探針（染料和材料類）相比，基因編碼探針像正常蛋白質一樣，可以定位到生物體特定細胞或特定細胞亞結構，具有低毒性、低背景、可遺傳等優點，在生命科學基礎研究中具有無可比擬的優勢。然而，現有的50多個基因編碼的cAMP熒光探針要么靈敏度低（熒光變化最大只有1.5倍），要么熒光亮度較暗，很難監測活體中微弱的內源性cAMP變化，極大地限制了生理和病理狀態下cAMP分子調控機理和功能的研究。

為了開發適用于活體檢測的高靈敏度探針，研究人員將環化重排綠色熒光蛋白(cpGFP)插入細菌MlotiK1通道蛋白的cAMP結合結構域(mlCNBD)中。經過插入位點篩選、連接肽優化、熒光蛋白及感應模塊優化，得到了具有高亮度、高靈敏度、合適親和力和快響應速度等特征的高性能基因編碼cAMP綠色熒光探針G-Flamp1。特別的，該探針在活細胞中的熒光變化可達12倍，是目前少數幾個在10倍以上的熒光探針之一。

隨后，研究人員將G-Flamp1探針應用在果蠅這一模式生物中。果蠅腦部蘑菇體(mushroom body)的Kenyon細胞中cAMP信號通路在氣味相關的記憶中發揮關鍵作用。研究人員首先獲取了Kenyon細胞中表達G-Flamp1探針的轉基因果蠅，然后利用雙光子成像發現，果蠅受到氣味或電擊刺激時，蘑菇體不同子區域呈現不一樣的cAMP信號時空變化，暗示不同子區域可能在聯想性學習中起著相對獨立的作用。

為驗證G-Flamp1探針在活體動物中檢測cAMP 動態變化的實用性，研究人員利用腺相關病毒在小鼠運動皮層中共表達綠色G-Flamp1探針和紅色jRGECO1a鈣探針。活體雙光子成像揭示了跑步運動中細胞特異性的cAMP信號，并與鈣信號無明顯相關性。這反映了小鼠運動時大腦皮層M1神經元反應的異質性。

最后，研究人員在小鼠大腦深部的伏隔核（NAc）腦區中表達G-Flamp1探針，并利用光纖記錄聽覺巴甫洛夫條件反射任務中該腦區cAMP信號的變化。結果表明，隨著訓練的熟練，小鼠得到獎賞時cAMP信號幅度在降低，而聽到相應聲頻信號時cAMP信號幅度在升高；該特性與多巴胺信號類似，暗示多巴胺釋放引起了cAMP信號。因此，G-Flamp1探針的高信噪比和高時間分辨率能夠高靈敏檢測到活體小鼠中內源性cAMP信號的動態變化。

綜上所述，該研究開發了一種適用于活體檢測的cAMP熒光探針，并初步揭示了果蠅和小鼠等模式生物在特定行為過程中特定神經元的cAMP信號變化的規律，為進一步理解cAMP信號的調控和功能奠定了基礎。

“與廣泛使用的鈣離子探針GCaMP相比，G-Flamp1才僅僅只是開始，目前已有幾十家國內外實驗室在使用G-Flamp1，未來將會有更多實驗室利用G-Flamp1來研究復雜的生物學問題。”論文通訊作者儲軍研究員表示。

在未來研究中，研究團隊將進一步提高探針性能，開發適用于不同應用場景的下一代高靈敏cAMP探針，并利用其揭示活細胞和活體中cAMP信號的規律、調控機制及生物學功能。與此同時，結合高內涵藥物篩選平臺，研究團隊開發的新型探針也將嘗試應用于針對GPCR受體的藥物篩選，以期發現更多的具有臨床價值的GPCR藥物。