本實驗討論用三磷酸核苷在可滲透細胞和分離的細胞組分體外標記蛋白的策略。這類實驗在大多數情況下還是以 [γ-32P] ATP 作為外源性磷酸供體。盡管在特殊情況下[γ-32P] GTP 也能被用于蛋白質標記。
| 實驗方法原理 | 檢測出目標蛋白是磷蛋白后，可將這個蛋白質的磷酸化過程在無細胞系統或天然細胞系統中進行研究。大多數蛋白激酶除了在細胞內還可在胞外進行許多底物的磷酸化。天然細胞的滲透化處理為得到滿意結果提供了一個有效的實驗方法，通過使用一些不同的試劑可以使細胞處于短暫的滲透狀態。這個過程使反應發生在細胞內環境，而信號轉導還能通過激素激活細胞表面受體而啟動。 |
|---|---|
| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | 細胞培養液細胞外緩沖液有滲透性的37℃緩沖液鏈球菌溶血素 O 工作溶液ATP 儲存溶液[γ-32P] ATP研究用藥理試劑受體激動劑2 × 冰裂解緩沖液蛋白抑制劑儲存溶液 |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 實驗試劑及儀器具體要求見「其他」。 1. 貼壁細胞培養： 1.1 實驗前約 1 h，將待標記細胞的培養液換為含有 20 mmol/L HEPES 的平衡培養液。重新放入培養箱，用新培養液平衡細胞。 1.2 將細胞培養皿置于 37℃ 水浴中 10 min, 再次平衡細胞。吸棄皿中培養液，用 10 ml 37℃ 預熱的胞外緩沖液迅速沖洗細胞 2 次，吸盡胞外緩沖液，加 0.5~2 ml 的有滲透性的緩沖液于培養皿中。對有些貼壁性較差的細胞，在清洗時要多加小心。 1.3 加鏈球菌溶血素 O （60 U/ml 工作液）于每塊培養皿中，終濃度 0.6 U/ml。按終濃度 100 mmol/L 加入預冷的 ATP 溶液（10 mmol/L 儲存液）。 1.4 37℃，培養細胞 1~5 min。培養時間取決于研究系統和細胞類型，應根據經驗確定。 1.5 加入 10 mCi/ml [γ-32P] ATP, 使終濃度達到 50~500 μCi/ml。 1.6 按研究需要加入藥理試劑、多肽或 Fab'片段等相關試劑，必要時加入受體激動劑，并按需求制訂它們的作用時間。 1.7 貼壁細胞培養。迅速吸盡有滲透性的緩沖液，加入 0.75 ml 預冷 2 × 裂解緩沖液，以停止反應，準備進一步的免疫沉淀。加入蛋白酶抑制劑和 DTT （儲存溶液），溶液各組分的終濃度為： 1 mmol/L PMSF 1 mmol/L 苯甲酸 5 μg/ml 抑肽素 A 5 μg/ml 亮抑蛋白酶肽 5 μg/ml 抗蛋白酶 1 mmol/L DTT 將培養板置于冰上，10 min，然后用細胞刮片從板底刮離細胞于緩沖液中。每板都必須更換新刮片。 1.8 轉移裂解液到帶旋蓋的微量離心管中（每管一個培養皿或一份細胞）。4℃，最大速度離心，將上清轉移至帶螺旋蓋的新離心管中，在干冰/乙醇浴中快速冷凍，儲存于 -70℃，備用（免疫沉淀）。 2. 懸浮培養： 2.1 實驗前約 1 h，轉移細胞至 50 ml 無菌離心管中，1000 g，室溫離心 5 min。棄上清，用 40 ml 37℃ 的胞外緩沖液沖洗細胞 2 次，1000 g，室溫離心 5 min，棄上清。 如果需要，在加入最終的胞外培養液后，細胞懸液可按等份分開。如下操作：在最后加入 40 ml 胞外培養液后輕輕重懸細胞，并將細胞按等份分入新管中，離心，移出并棄去上清，在進行步驟 2.2 前完成清洗過程。 2.2 以 1 × 107 細胞/ml 的濃度將細胞重懸于 37℃ 的胞外緩沖液中，37℃ 下通過輕柔的渦旋平衡細胞 15~30 min，再次室溫 1000 g 離心 5 min，吸盡緩沖液。 如果實驗中使用較敏感的細胞（如血小板），這一步驟應被修正：平衡時間可減至 5~10 min，渦旋細胞的步驟也可省略。 2.3 按 0.6 U/ml 的終濃度將鏈球菌溶血素 O （60 U/ml 工作溶液）加入新配制的 37℃ 有滲透性的緩沖液，加入預冷 ATP 溶液（10 mmol/L 儲存液），終濃度 100 μmol/L。 將含有鏈球菌溶血素 O 和 ATP 的有滲透性的緩沖液與細胞輕輕充分混勻。 2.4 37℃，培養細胞 1~5 min。 培養時間取決于研究系統和細胞類型，應根據經驗確定。 2.5 加入 10 mCi/ml [γ-32P] ATP, 使終濃度達到 50~500 μCi/ml。 2.6 按研究需要加入藥理試劑、多肽或 Fab'片段等相關試劑，必要時加入受體激動劑，并按需求制訂它們的作用時間。 2.7 懸浮培養。加入等體積冰浴的 2 × 裂解緩沖液，停止反應，準備進一步的免疫沉淀，加入蛋白酶抑制劑和 DTT，溶液中各組分的濃度與 1.7 中相同。放置細胞在冰上，10 min。 2.8 轉移裂解液到帶旋蓋的微量離心管中（每管一個培養皿或一份細胞）。4℃，最大速度離心，將上清轉移至帶螺旋蓋的新離心管中，在干冰/乙醇浴中快速冷凍，儲存于 -70℃，備用（免疫沉淀）。 |
| 注意事項 | 1. 再怎么強調也不為過的是每個研究者應當完全熟悉當地關于 32P 管理和處理規范，并具備處理 32P 污染的設備。 2. 此單元中所用水應為 Milli-Q 純凈水或純凈級別與之相當的水。 3. 通常購買的 [γ-32P] ATP，活性約為 3000 Ci/mol，濃度約為 10 mCi/ml。5 μl 的儲存液含有 50 μCi/ml 的 [γ-32P] ATP, 此濃度正好可用于標記。若儲存的 [γ-32P] ATP 用其他溶液稀釋，最好在使用前再稀釋。 4. 在步驟 1.6 和 2.6 中，依據部分預試驗的數據和經驗制定特殊試劑的反應時間。[γ-32P] ATP 與鏈球菌溶血素 O 和預冷ATP 在同一時間加入。 |
| 其他 | 試劑： 適宜的細胞培養液。含 20 mmol/L HEPES 的緩沖液 pH 7.2，37℃ 預熱研究用細胞（傳代細胞或被分離的原代細胞） 細胞外緩沖液，37℃ 有滲透性的緩沖液，37℃ 60 U/ml 鏈球菌溶血素 O 工作溶液，新鮮制備 10 mmol/L 預冷的 ATP 儲存溶液 10 mCi/ml [γ-32P] ATP （3000 Ci/mmol；DuPont NEN） 研究用的藥理試劑，多肽或 Fab'片段 適宜的受體激動劑 2 × 免疫沉淀用裂解緩沖液，冰浴。 蛋白抑制劑儲存溶液（儲存在無水乙醇中，-20℃ 可儲存 6 個月以上）： 100 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF） 100 mmol/L 苯甲脒 1 mg/ml 抑胃酶肽 A 1 mg/ml 亮抑蛋白酶肽 1 mg/ml 抗蛋白酶 100 mmol/L DTT 儀器： 干冰/乙醇浴 具有多細胞皿架（金屬網架最佳）的 37℃ 無循環水浴箱 50 ml 離心管 臺式離心機 細胞刮片 帶螺旋蓋的微量離心管 |
