溶菌酶純度鑒定與分子量測定

一、實驗目的和內容

目的：1. 通過本次實驗的學習與操作，使學生在實驗過程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）測定蛋白質純度與分子量的原理與依據；

2. 要求學生掌握電泳原理以及SDS－PAGE垂直板電泳分離蛋白質技術；

3. 熟悉垂直板電泳操作原理和方法，凝膠染色與脫色方法，凝膠圖譜的繪制與計算；

4. 了解在電泳中分子量標準物的使用。

內容：1．SDS-PAGE電泳的原理：SDS使蛋白質的變性作用，以及此實驗中采用的使不連續PAGE膠（分離膠和濃縮膠）的原理；

2．SDS－PAGE電泳進行純度鑒定的原理：凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質分子量密切相關；

3．電泳的操作：制膠、加樣、電泳、撥膠、凝膠染色與脫色；

4．蛋白條帶的觀察以及分子量的估算。

二、實驗儀器與試劑

1．實驗儀器

　　SDS-PAGE電泳設備，電爐，脫色搖床

易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物試劑庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

2. 實驗材料及試劑

實驗材料：蛋清（S1）、粗分離樣品（S2）、離子交換層析中穿透峰下降段樣品（S3）、離子交換層析洗脫峰樣品（S4），橡膠手套

實驗試劑：2×上樣緩沖液、10%SDS、30%丙烯酰胺貯存液、分離膠緩沖液（1.5 mol/LpH8.8 Tris-HCl 緩沖液）、濃縮膠緩沖液（0.5 mol/LpH6.8 Tris-HCl 緩沖液）、10%過硫酸銨(AP)、TEMED、pH8.3 Tris-Gly電泳緩沖液、1%瓊脂糖溶液、染色液、脫色液

三、實驗步驟

（一）蛋白樣品的處理

取200μL 上述備用蛋白樣品于帶塞的小離心管中，加入200μL 的2×上樣緩沖液，混勻，輕輕蓋上蓋子，封口膜封緊瓶口以免加熱時迸出，在100℃沸水浴中加熱3～5min，取出后10000r/min 離心10min，取上清待用。

（二）SDS-PADE實驗步驟（適用于大板，若為天能公司的小板，參考附錄中的方法）

1．電泳玻璃板洗凈，并把玻璃板在灌膠支架上固定好。( 試樣格（梳子）臨用前用無水乙醇擦拭，讓其揮發至干。)

2．用電泳緩沖液配制1%的瓊脂糖凝膠，煮沸溶解后冷卻至55℃左右，加入制板槽槽內封板。（固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.）

3．按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約5cm左右，之后加少許蒸餾水，靜置30分鐘。（凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。）

4．倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠,連續平穩加入濃縮膠至離邊緣5mm處，迅速插入樣梳，靜置25分鐘。（樣梳需一次平穩插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。）

5．拔出樣梳后，在上槽內加入緩沖液，沒過鋸齒時可拆去底端的瓊脂糖。（要使鋸齒孔內的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.）

6．加樣5個，空出第一個孔，從第二個開始按已編排好的順序依次加入相應體積的樣品和蛋白Marker。其中蛋清（S1）和Marker加樣量為2μL，S1、S2、S3、和S4加樣量為10μL。為了練習和比較上樣量的影響，可以加20μL的S1～S4作為對照（注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下沉時會發生擴散。為避免邊緣效應，最好選用中部的孔注樣。）

7．電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電壓恒定在160V，當進入分離膠后改為240V，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。

8．凝膠板剝離與染色：電泳結束后，用專用工具撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記，然后放在大培養皿內，加入染色液，42℃染色40min左右。（剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分。）

9．脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液脫色，直到蛋白質區帶清晰。

10．將凝膠室溫保存于10％甘油水溶液中，至凝膠掃描分析。

11．凝膠掃描儀掃描并進行數據分析,求出溶菌酶的相對分子質量。分析各樣品中溶菌酶相對含量的變化。

附表1

附表2

匯總所有實驗結果，完成下表：

其中：總活力＝比活力×體積

回收率＝回收的樣品活力占總活力的百分數

提純倍數＝提純的比活力與初始比活力的比值

四、注意事項

1．N,N’-亞甲雙丙烯酰胺為神經毒性物質，可經皮膚直接吸收，使用時應避免其直接接觸皮膚，必要時應戴手套。但其凝固后就變成無毒物質。

2．安裝電泳槽時要注意均勻用力旋緊固定螺絲，避免緩沖液滲漏。

3．用瓊脂(糖)封底及灌膠時不能有氣泡，以免電泳時影響電流的通過。

4．加樣時樣品不能超出凹形樣品槽。加樣槽中不能有氣泡，如有氣泡，可用注射器針頭挑除。

五、演示

1．垂直電泳系統的組成及工作原理；

（1）電泳槽：是凝膠電泳系統的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽

（2）電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200～600V，載體兩性電解質等電聚焦電泳1000～2000V，固相梯度等電聚焦3000～8000V

（3）外循環恒溫系統:高電壓會產生高熱，需冷卻；

（4）灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子；

（5）其他：可以選配電泳轉移裝置、電泳洗脫儀、凝膠掃描和攝錄裝置等。

2．制分離膠與濃縮膠。