實驗概要
本實驗介紹了溶血空斑試驗即小室液相法(Test of Plague Forming Cell)的基本原理及操作步驟。
實驗原理
溶血空斑試驗，又稱空斑形成細胞（Plague Forming Cell，PFC）試驗，是一種體外檢測抗體形成細胞的方法。將一定量洗滌過的綿羊紅細胞注射入小鼠腹腔，四天后將小鼠殺死，取脾臟制成脾細胞懸液，內含抗體形成細胞。然后將脾細胞、綿羊紅細胞，補體混合孵育。由于PFC 所分泌的抗體和綿羊紅血球結合形成抗原抗體復合物，在補體作用下可使紅細胞溶解，于特制的小室內形成肉眼可見的溶血空斑。一個空斑即代表一個抗體形成細胞。
主要試劑
1. 5％和10％綿羊紅血球（SRBC）
2. 補體(經SRBC 吸收，臨用時稀釋成合適濃度)
主要設備
1. 解剖器械
2. 試管
3. 1ml 吸量管
4. 載玻片
5. 石蠟盤
6. 酒精燈
7. 微量加樣器
實驗材料
ICR 小鼠
實驗步驟
1. 小鼠免疫及脾細胞懸液的制備
將5％SRBC 0.4ml注射于小鼠腹腔，4 天后拉脫頸椎處死，取出脾臟放在已加入6ml Hank's液的平皿中。在100 目不銹鋼網上研磨，過濾混勻，從中吸取lml加入試管中，加滿Hank's液混勻，離心1000rpm，10 分鐘。將沉淀的脾細胞恢復lml容積，即為約1×107／ml濃度的細胞懸液。
2．制作小室
取無脂載玻片（75mm×25mm），平置桌面上。用雙面膠帶在載玻片兩端和中間各粘一條，然后再覆蓋上同樣的載玻片，即形成兩個小室。將此雙層玻片的一側長邊浸入融化的石臘池中以封閉小室的一邊（無需浸入過深，以能封閉小室邊緣為準）。
3. 小室灌注細胞懸液
取1×107／ml脾細胞懸液100μl
10％SRBC 200μl
新配補體 200μl
Hank's 液 1ml
混勻后，用尖吸管灌注小室、蠟封、標記、平放于玻片盤內，置37℃孵箱30—45 分鐘。
4. 實驗結果
觀察小室內的透明空斑，一個空斑即代表一個空斑形成細胞（PFC），即B細胞。
注意事項
1. 小室注入液體時不要留有氣泡。
2. 小室邊緣需用石蠟封嚴。
3. 37℃孵箱孵育時，必須放平，不可傾斜。
4. 觀察結果時，應注意辨別空斑與氣泡的區別，避免將氣泡誤認為溶血空斑。