溶酶體的功能有二：一是與食物泡融合，將細胞吞噬進的食物或致病菌等大顆粒物質消化成生物大分子，殘渣通過胞吐作用排出細胞；二是在細胞分化過程中，某些衰老的細胞器和生物大分子等陷入溶酶體內并被消化掉，這是機體自身更新組織的需要。
溶酶體的主要作用是消化作用，是細胞內的消化器官，細胞自溶，防御以及對某些物質的利用均與溶酶體的消化作用有關。
細胞內消化：對高等動物而言細胞的營養物質主要來源于血液中的大分子物質，而一些大分子物質通過內吞作用進入細胞，如內吞低密脂蛋白獲得膽固醇，對一些單細胞真核生物，溶酶體的消化作用就更為重要了。
細胞凋亡：個體發生過程中往往涉及組織或器官的改造或重建，如昆蟲和蛙類的變態發育等等。這一過程是在基因控制下實現的，稱為程序性細胞死亡，注定要消除的細胞以出芽的形式形成凋亡小體，被巨噬細胞吞噬并消化。
自體吞噬：清除細胞中無用的生物大分子，衰老的細胞器等，如許多生物大分子的半衰期只有幾小時至幾天，肝細胞中線粒體的平均壽命約10天左右。
防御作用：如吞噬細胞可吞入病原體，在溶酶體中將病原體殺死和降解。
參與分泌過程的調節，如將甲狀腺球蛋白降解成有活性的甲狀腺素。
形成精子的頂體：頂體相當于一個化學鉆，可溶穿卵子的皮層，使精子進入卵子。
選擇性地包裝成初級溶酶體。
所有白細胞均含有溶酶體性質的顆粒，能消滅入侵的微生物。然而，也有一些病源菌（如麻風桿菌、結核桿菌等）能耐受溶酶體酶的作用，因而能在巨噬細胞內存活。溶酶體在病理過程中也有重要意義。由于肺巨噬細胞吞噬吸入的硅或石棉粉塵，引起溶酶體破裂和水解酶的釋放，刺激結締組織纖維的增加，導致硅肺的發生。組織缺氧（如心肌梗死）也可造成溶酶體的急性釋放，使血液中有關酶的濃度迅速增高。