灌注固定實驗

實驗動物

無水乙醇二甲苯酒精甘油生理鹽水等

灌注瓶針管剪刀攝子止血鉗組織鉗咬骨鉗等

1灌注固定用1%戊巴比妥鈉(80mg/kg)麻醉動物，沿胸骨柄剪開胸腔，剪開心包膜，暴露心臟，與心尖成30°-45°夾角剪開左心室，再剪開右心耳，將灌注針頭從左心室插入主動脈，固定針頭（圖2-I),然灌注固定用1%戊巴比妥鈉(80mg/kg)麻醉動物，沿胸骨柄剪開胸腔，剪開心包膜，暴露心臟，與心尖成30°-45°夾角剪開左心室，再剪開右心耳，將灌注針頭從左心室插入主動脈，固定針頭（圖2-I),然后快速用生理鹽水沖洗血液，再先快后慢注入固定液灌流固定1.5h（表2-2),如若固定的不理想可將材料取出后固定2-4h(4℃)

2取材動物經過灌注固定后須及時取材，組織所取部位、大小、形狀根據實驗需求遵循動作輕柔、避免擠壓、切片平整、目的組織完整等原則。取出所需組織，放入20%蔗糖液中浸泡(4℃),直至組織完全脫水沉底。

(1)灌流要迅速，生理鹽水不宜過多。固定液的灌注要先快后慢，以便充分固定。

(2)固定液總最通常為動物全身血液的2倍左右。

(3)浸泡固定時固定液體積是組織的20倍左右。

(4)取材需謹慎，勿撕扯組織，或用力過猛，造成組織損傷。

(5)戊巴比妥鈉、苦味酸等試劑屬于毒、麻藥品，需專人管理。

其他試劑：①1%戊巴比妥鈉溶液(100ml)稱取戊巴比妥鈉1g,生理鹽水100ml,充分溶解(4℃放置）；②0.1mol/L PB緩沖液(1000ml)分別稱取KH₂P0₄ 13.6g,NaOH 3.20g,加雙蒸水至1000ml,調pH至7.4; ③4%多聚甲醛溶液(1000ml)分別稱取NaOH 3.20g,多聚甲醛40g,KH₂P0₄ 16.80g,蒸餾水溶解，過濾后定容，調pH至7.4(需用攪拌器攪拌，注意添加順序，前一種完全溶解再加下一種，不需加熱可迅速溶解）；④多聚甲醛?戊二醛?苦味酸混合固定液；

(1)固定液的選擇很重要，甲醇對抗原保存不理想，乙醇不適合用于T和B細胞抗原固定。

(2)灌流固定是做好免疫組化關鍵的第一步。生理鹽水不宜過多，防止過多引起組織水腫，動物灌流固定結束后，應及時取材(2h內），避免長時間擱置。動物若灌流固定不好，可在取材后再后固定2-4h(4℃)。