說明
物種鑒定系列可針對食品、飼料等樣品中動物源性成分的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。本產品用于豬源性成分的檢測，檢出限為0.1%。
◆ 產品組成（48測試）
021012MⅡ | |
試劑 | 含量 |
A-豬源-P | 20μL × 8管× 6排 |
NG-P | 100μL × 2支 |
PG-豬源-P | 100μL × 1支 |
適用儀器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。
◆ 自備耗材和儀器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬浴。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。
1）第一區：樣本制備區。
2）第二區：模板添加區。
3）第三區：擴增及產物分析區。
分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。
5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。
◆ 樣品處理
參照《SN/T 3730.8-2013 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第8部分：豬成分檢測 實時熒光PCR法》或其他標準處理樣品，制備的樣本保存待用。
樣品的采集和制備是動物源性鑒別的重要步驟，為防止交叉污染，應使用一次性消耗品，研缽應經160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應使用1%次氯酸鈉溶液浸泡。
取樣應盡量采取肌肉組織，對于同一批樣品，應多點采集合并后，作為一份樣品進行均質，提取DNA。
采樣過程應快速完成，將采取的樣品迅速放入組織攪碎機中進行均質成糜狀，充分混勻，取0.1 g充分混勻的樣品，采用液氮研磨或均質器均質。
詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。
◆ 實驗操作
1.模板制備（樣本制備區）
建議使用試劑配套動物基因組DNA提取系列產品，具體過程詳見產品說明書。
2.添加模板（模板添加區，放置于冰盒上進行）
剪下所需測試數的已含有反應液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-豬源-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。
3.擴增反應（擴增及產物分析區）
使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。
按下列條件設置擴增反應：
PCR循環 | 熒光收集位點 | ||
95℃ | 10分鐘 | 1個循環 | — |
95℃ | 15秒 | 40個循環 | — |
60℃ | 1分鐘 | ※ |
4.基線和閾值設定
基線調整取3-15個循環的熒光信號，閾值線應超過陰性對照擴增曲線的最高點
◆結果判定
檢測樣品無Ct值，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有豬源性成分或含量低于檢出限；
檢測樣品Ct≤35，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有豬源性成分；
檢測樣品Ct＞35，可直接報告樣品陰性，不含有豬源性成分或含量低于檢測限。
NG反應為平滑直線，PG反應為“S”型擴增曲線，此次檢測結果有效，否則無效。
