環狀RNA研究深度剖析（一）

1.環狀RNA為什么火？它到底是何方神圣？

2013年兩篇Nature[1][2]文章的出世，徹底顛覆了我們對RNA的傳統認知，同時也迅速引爆了整個生物醫學界！經過嚴格統計匯總后，2017年國家自然科學金獲批的項目中環狀RNA研究相關的項目總數高達176項，其中有兩項杰出青年基金，一項優秀青年基金，兩項重點項目，94項面上項目，62項青年基金項目，15項地區科學基金項目。

從獲批學科方向角度分析，發現腫瘤學方向是環狀RNA研究獲批項目中最多的學科方向，而消化系統相關腫瘤是其中獲批最多的學科單項，除此之外，循環系統的環狀RNA研究也是異軍突起，一躍成為第二大環狀RNA研究領域。其實醫學方向除了腫瘤學和循環系統以外，其他方向也都獲得資助，比如中醫學和藥理學方向，相信未來其他類型的腫瘤和學科方向必定會爭取更多的環狀RNA課題資助。與此同時，生命科學方向環狀RNA研究顯得略微低調些，從獲批的16個項目來看，基礎的遺傳學和生物信息學(C06)和畜牧業(C1701)相對受到更多的重視，相信如果突破相關研究領域的技術瓶頸，在生命科學方向會出現更多的環狀RNA研究項目。

從獲批研究內容分析，發現與2016年相比，2017年獲批的項目中，只進行環狀RNA表達譜分析的課題非常少，絕大部分是針對環狀RNA的功能機制展開，這表明環狀RNA研究已經實現從基礎篩選到特定功能機制研究的過度。值得一提的是，其中環狀RNA與microRNA相互作用是目前最常見的，也是項目數占比最多的研究思路，另外外泌體來源的環狀RNA項目也比較多，也是目前環狀RNA的重要方向。 那么接下來，小編將從以下幾個角度講解環狀RNA目前的研究思路。 環狀RNA是什么？ 環狀RNA（circRNAs）是一類不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環形結構的非編碼RNA分子。目前發現的circRNAs主要來源于基因外顯子exon，但還有其他類型，比如來源于內含子intron，基因間intergenic，反義鏈antisense，重疊區sense overlapping。

circRNA的主要特征有哪些呢？ (1)circRNA由于反式剪切，大量存在于真核細胞的細胞質中（定位于細胞質是miRNA海綿機制研究的充分必要條件），少部分內含子來源的circRNA存在于核酸內，具有一定的組織特異性、時序和疾病特異性（灰常適合做分子標志物哦）。circRNA廣泛存在于人體細胞中，有時超過其線性異構體10倍之多。 (2)與傳統線性RNA相比，circRNA分子沒有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，呈封閉環狀結構，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比線性RNA更穩定。（RNaseR耐受實驗，驗證circRNA的環形結構） (3)部分circRNA含有miRNA應答元件，可充當競爭性內源RNA（ceRNA），與miRNA結合，在細胞中起到miRNA海綿作用，進而解除miRNA對靶基因的抑制作用，上調靶基因的表達水平。（具體研究見下） (4)可以翻譯成蛋白質，但大部分是非編碼RNA。（與表觀結合：可通過m6A甲基化翻譯蛋白質[3]）

2.環狀RNA的研究思路是怎樣的呢？ 

所謂兵馬未動，糧草先行！環狀RNA的研究也是一場沒有硝煙的戰爭，須得搶占先機，方能知己知彼，百戰不殆。為了各位在這場“戰爭”中取得勝利，云序生物為大家準備了環狀RNA研究的思路寶典，如下。 從文章的工作量、難易程度及雜志發表角度看，小編把環狀RNA研究思路分為表達譜分析，生物標志物，功能機制研究三大類。那么接下來小編將從這三個角度給大家詳述。 不論從哪一個角度，首先需要確定好研究物種，疾病模型，樣品類型等基本信息。接下來，通過高通量手段即RNA-seq（云序提供全轉錄組-seq或circRNA-seq）或文獻報道，篩選差異表達的circRNA。如果想短平快的發表3-5分的文章，那么表達譜分析顯得再合適不過了。如果有大量的臨床樣本，那么做分子標志物也是很easy的，思路和表達譜分析相似如下圖展示，不過多了臨床樣本的統計和驗證。（比如KM曲線，ROC曲線，PAM分析等等）

接下來，便是重頭戲，circRNA功能機制研究如何進行呢？ 這要看各位想從哪個角度入手了。目前circRNA研究的功能機制大致分為：miRNA海綿，與功能蛋白結合，順勢調控來源基因表達，還有就是circRNA上發生RNA甲基化可翻譯蛋白質等。其中miRNA海綿是目前做的最普遍，也是目前申請的國自然里占比最多的。接下來小編會好好介紹一下這一方面的研究思路及研究方法。 miRNA海綿機制： 通過高通量測序手段得到一批數據后，很多人會犯愁到底怎么運用數據呢？想必下面這篇文章[4]大家都爛熟于心了吧？那么小編再次帶大家領略一下高分環狀RNA的風采。

高通量測序產生的數據，需要進一步實驗手段進行驗證。而在諸如Nature communication這類高分雜志中，驗證工作可謂是面面俱到。不僅包括表達量驗證，還包括結構驗證，細胞定位及功能驗證等。有的甚至還包括環狀RNA形成機制的研究，在這兒不贅述。

體外差異環狀RNA的驗證 a表達量驗證：qPCR b結構驗證：由于circRNA不易被核酸外切酶RNaseR降解，比線性RNA更穩定。可通過RNase R耐受性實驗驗證其環形結構。 c細胞定位：由于circRNA是在細胞質中發揮miRNA海綿機制，因此需要通過核質分離實驗或FISH驗證其在細胞中的定位。 d功能驗證：對上述步驟篩選出的1-2條circRNA設計siRNA或者過表達質粒，通過一系列細胞表型實驗，驗證circRNA所發揮的細胞功能。最終挑選表型最為顯著的circRNA做后續機制研究。