環狀RNA作為研究持續火熱的明星分子，不同于對其豐富的表達譜研究，環狀RNA功能機制研究還僅僅處在起步階段。環狀RNA研究多為miRNA海綿機制，部分circRNA可競爭性結合miRNA，解除miRNA對靶基因的抑制作用，上調靶基因的表達。其實，環狀RNA可以通過結合不同種類的功能蛋白，分別在轉錄前、后及翻譯水平嚴格調控細胞生殖生長等過程。云序曾對環狀RNA經典研究思路進行過詳細解析（2018國自然研究熱點—環狀RNA研究深度剖析），感興趣的老師可以查詢瀏覽。4月3日，知名免疫學雜志Immunity（IF：22.845）在線發表了中科院生物物理所范祖森教授與王碩研究員為共同通訊作者的文章，介紹發現環狀RNA Cia-cGAS定位于細胞核，可結合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑制其活性，調控長效造血干細胞（LT-HSC）靜息狀態。本文極大拓展了核內環狀RNA通過結合激酶發揮重要生理功能的研究思路。
研究背景：
造血干細胞（HSC）自我更新和分化之間的平衡打破將導致骨髓衰竭及惡性血液腫瘤發生。然而，HSCs如何維持其靜止狀態并避免I型干擾素（IFN）介導能量耗竭、細胞凋亡仍未可知。本文一種名為cia-cGAS的環狀RNA，它在長效（LT）-HSCs細胞核中高度表達。小鼠Cia-cGAS缺陷將導致I型IFN在骨髓中高表達并伴隨靜息LT-HSC數量顯著減少。在穩態條件下，cia-cGAS在細胞核中通過結合DNA傳感器cGAS以阻斷其合酶活性，由此保護靜息LT-HSC免于被cGAS介導耗盡凋亡。此外，cia-cGAS與線性cGAS相比，與cGAS結合親和力更強，由此抑制cGAS介導LT-HSCs中I型IFN產生。本文揭示了一個新型環狀RNA——cia-cGAS可結合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑制其活性，調控長效造血干細胞（LT-HSC）靜息狀態。
研究思路：
本文首先基于高通量手段比較了小鼠中LT-HSC，ST-HSC和MPPs中全轉錄組變化，共發現156種顯著性差異表達的circRNAs。表達量驗證證實9個circRNA在LT-HSC中顯著性上調。在細胞表型層面，發現只有干擾D430042O09Rik轉錄的circRNA——Cia-cGAS后，可明顯改變造血干細胞的亞群分布，作者因此錨定Cia-cGAS進行機制分析。作者通過Cas-9基因敲除策略成功構建了Cia-cGAS基因敲除小鼠，在Cia-cGAS基因敲除小鼠中LT-HSC顯著性減少，I型IFN表達升高。通過RNA Pull-down實驗，作者發現Cia-cGAS可以與cGAS結合，cGAS-RIP實驗反向證實二者之間具有直接的相互作用。后續，作者通過生信預測結合EMSA實驗分析了Cia-cGAS與cGAS相互作用的位點信息。酶學研究證明，Cia-cGAS可通過結合cGAS并抑制其活性。
研究一：環狀RNA分子篩選及驗證
為探索造血干細胞功能相關的circRNA分子，作者比較了小鼠不同造血干細胞（LT-HSC，ST-HSC和MPPs）中全轉錄組變化情況，找出了156種顯著性差異表達的circRNA分子，其中49種在LT-HSC中高表達。RNase R及qPCR實驗證實其中9種為真實LT-HSC中高表達環狀RNA 分子。為有效篩選造血干細胞相關的circRNA分子，作者通過體內circRNA干擾實驗，發現只有干擾Cia-cGAS后才能明顯影響小鼠體內造血干細胞亞群分布，并表現為LSK祖細胞數量顯著性增加，與此同時LT-HSC細胞數量顯著減少。因此，作者結合轉錄組數據以及體內、體外驗證實驗，最終錨定Cia-cGAS分子進行后續分子機制研究。
研究二：環狀RNA分子細胞表型
作者發現Cia-cGAS是由D430042O09Rik (chr7: 125776974–125784712)的4、5、6號外顯子連接成環。且位于外顯子上下游的內含子區域具有成環所需高度同源序列。作者通過Cas9技術手段，敲除一端同源序列后，成功獲得Cia-cGAS 敲除小鼠模型。敲除小鼠中LSK祖細胞顯著增多，LT-HSC顯著減少，且基因敲除小鼠出生6個月后會死于貧血。對基因敲除小鼠中LT-HSC進行BrdU染色，結果說明敲除小鼠中LT-HSC細胞處于增殖分裂活躍期。同時脈沖標記H2B-GFP小鼠模型證實Cia-cGAS敲除后，靜息狀態的LT-HSC細胞比例顯著性降低。
研究三：環狀RNA分子功能機制
在確定Cia-cGAS具有明顯細胞表型之后，作者圍繞其分子機制展開了詳細的探索。為了找到Cia-cGAS影響下游的靶基因，作者在敲除Cia-cGAS后進行轉錄組分析，發現差異表達的基因與IFN-α下游靶基因是一致的。且當Cia-cGAS敲除后I型IFN mRNAs 表達量也顯著性增高。最終，作者證實cia-cGAS通過調控I型IFN通路影響LT-HSC靜息狀態。接下來，作者針對Cia-cGAS在該通路中的作用機理進行了詳細解析。作者直接采用RNA Pull Down技術手段找到與Cia-cGAS相互作用的功能蛋白。基于這一技術手段，作者發現Cia-cGAS與cGAS蛋白具有明顯相互作用。cGAS RIP實驗反向證實二者之間具有真實的相互作用。免疫熒光及FISH實驗證實Cia-cGAS及cGAS細胞內共定位表達。基于EMSA等技術手段，作者找到了二者相互作用位點。后續作者補充大量生理生化實驗，最終揭示LT-HSC中Cia-cGAS結合并抑制cGAS的活性，最終通過拮抗cGAS催化產物I型IFN來維持HSCs靜息狀態。
總結：
本文從環狀RNA結合功能蛋白角度，成功的向我們展示了核內circRNA具有重要生理功能，以及該類型circRNA的研究方法。首先通過高通量測序篩選與造血干細胞干性維持相關的circRNA分子，圍繞該分子設計一系列體內、體外干擾實驗，確定其可引起干細胞干性維持相關細胞表型改變。后續，與circRNA 海綿機制研究類似，RNA Pull Down實驗及RIP實驗成為機制研究成功與否的關鍵鑰匙。作者基于RNA Pull-down技術篩選到可能與Cia-cGAS相互作用的蛋白質，并進一步通過RIP實驗反向驗證。在補充大量生理生化實驗后，作者向我們完整的描繪了Cia-cGAS如何維持HSCs靜息狀態。本文給我們提供了很好的范本，當我們篩選到的環狀RNA定位于核內，或者不能與AGO2蛋白結合，不適合進行海綿機制研究時，我們可采取的研究策略。
云序專注于環狀RNA研究，前期環狀RNA篩選，云序提供全轉錄組及環狀RNA測序相關服務；環狀RNA驗證，云序提供qPCR，RNaseR及Sanger測序等服務；文中環狀RNA機制研究金鑰匙——環狀RNA Pull Down及RIP 環狀RNA測序，云序均可提供全套服務！新年伊始，云序客戶更是在環狀RNA領域接連發表高分文章，包括世界首篇小鼠大腦創傷外泌體環狀RNA文章；世界首篇非洲爪蟾環狀RNA研究以及世界首篇紅斑狼瘡性腎炎環狀RNA文章等等。云序致力于幫助客戶在環狀RNA研究領域占得先機，拔得頭籌！
作者簡介：
范祖森，二級研究員，現任中科院感染與免疫重點實驗室副主任，國科大微免教研室副主任，中國科學院特聘核心骨干研究員,國科大崗位教授（A類）。范祖森1998年獲上海交通大學醫學院免疫學博士學位，隨后到哈佛大學醫學院從事博士后研究，于2003年晉升為哈佛大學講師。2004年作為中國科學院“百人計劃”研究員回到生物物理所工作，2005年獲“杰出青年”基金資助，2006年入選“新世紀百千萬人才工程”國家級人才。2010年享受“國務院特殊津貼”專家。2014年獲得談家楨生命科學創新獎，2016年評為中科院優秀研究生導師。課題組長期從事天然免疫抗感染應答調控、腫瘤干細胞和腫瘤免疫治療等研究，在天然免疫細胞新亞群發現、天然免疫抗感染識別機制、腫瘤干細胞自我更新機制等方面，取得了一系列有國際影響力的原創性成果。以第一及通訊作者在Cell（2篇）、Nat Immunol（5篇）、Immunity（2篇）、Cell Stem Cell（2篇）、JEM（3篇）、JCI、NSMB、Nat Commun（8篇）、 EMBO J（2篇）、Blood等國際權威學術期刊發表SCI高水平研究論文70余篇，研究處于國際前沿。課題組經過多年的研究積累業已形成優秀的免疫學研究平臺和優良的科研文化氛圍，在天然免疫抗感染應答與腫瘤免疫領域培養出一支優秀的科研團隊。已培養了30余位博士畢業生和近10位博士后，10余人獲得中科院院長特別獎、優秀獎及優秀博士論文，有近10人晉升為教授崗位（包括北大、清華教授），3人獲得中組部“青年千人”計劃，1人獲得基金委“優青”等。
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RNA甲基化領域是當前最耀眼的國際科研明星，也是國自然申請的大熱點；究其原因，是因為最近一兩年，RNA甲基化的功能與分子機制方面取得了巨大的進展。RNA甲基化已被證實在癌癥發生發展，病毒感染，神經發育，干細胞分化等過程中發揮著關鍵作用。今天，我們承接上一期的癌癥篇，為您帶來病毒領域的RNA甲基化研究進展。
1.Nature Immunology：DDX46影響抗病毒RNA的去m6A甲基化，抑制細胞的抗病毒免疫應答
影響因子：21.5，2017.8.28
中國醫學科學院聯合上海第二軍醫大學團隊證實RNA解旋酶DDX46通過RNA去甲基化修飾，抑制水泡型口炎病毒（VSV）的天然免疫應答。那為什么作者會鎖定DDX46來做研究呢？因為大多數DDX家族成員參與mRNA剪接，其中有三個成員（DDX1，DDX3和DDX41）作為胞質感受器還參與了抗病毒的天然免疫反應。于是，作者希望能夠找到其它參與mRNA剪接且在核內影響宿主抗病毒反應的DDX家族成員。作者將DDX家族的7個成員（DDX5，17，23，39，42，46和48）作為候選，應用siRNA敲低其表達，發現只有敲低DDX46表達才能顯著增加VSV病毒感染后干擾素的產生。為進一步揭示DDX46功能，作者應用CLIP測序，發現DDX46與抗病毒基因（Mavs，Traf3和Traf6）通過與共有保守結構域CCGGUU結合而起作用。在分子機制上，作者以去甲基化酶ALKBH5為研究對象，應用RIP測序，發現感染病毒后細胞核內DDX46與ALKBH5結合顯著增加，使得與DDX46結合的抗病毒效應分子mRNA發生去甲基化修飾，導致復合物在核內滯留，抑制了抗病毒效應分子蛋白的表達，從而降低干擾素產生，最終抑制抗病毒天然免疫應答反應。
圖1. RIP測序檢測感染DDX46與ALKBH5結合的增加
2. Nature Microbiology：HIV病毒感染促進自身及宿主淋巴細胞的m6A RNA甲基化
2016.2.22
同樣來自Nature的子刊，加州大學圣地亞哥醫學院Tariq團隊利用HIV感染CD4淋巴細胞（該細胞為艾滋病病毒的主要攻擊對象），在病毒感染增殖期（感染后第3天）取樣進行實驗。作者應用m6A RNA甲基化測序和northern blot技術結合， 證實HIV-1病毒感染淋巴細胞后，不管是病毒自身的RNA，還是宿主細胞的RNA，能促進RNA的甲基化反應。研究團隊應shRNA，在CD4 T淋巴細胞敲低m6A甲基轉移酶METTL3和METTL14，發現HIV-1的復制受到抑制，在敲低甲基轉移酶ALKBH5，發現促進了HIV的復制。作者通過m6A RNA甲基化測序，檢測到HIV RNA上有14個m6A甲基化peak，接著再應用m6A RNA甲基化測序，在受感染CD4 T淋巴細胞中篩選到56個因m6A甲基化修飾而差異表達的轉錄因子，GO分析表明這些轉錄因子和病毒基因的表達調控有密切關系。為了進一步研究病毒RNA甲基化位點功能，作者在第11個peak的莖環結構IIB區將A7877和A7883位點做甲基化處理，發現人類和病毒RNA中m6A修飾促進Rev蛋白和RRE RNA的結合，從而調控RNA出核。
圖2. HIV-1病毒感染CD4 T淋巴細胞后m6A修飾的作用機制
3. Cell Host & Microbe：m6A RNA甲基化修飾調控黃病毒感染
影響因子：14.9，2016.11.9
杜克大學醫學院Stacy研究團隊研究了m6A RNA甲基化修飾對丙型肝炎病毒（HCV）感染的影響。他們發現，在Huh7細胞內利用siRNA敲低甲基轉移酶METTL3和METTL14后，HCV的非結構蛋白NS5A的表達明顯升高，當敲低去甲基化酶FTO后，NS5A蛋白表達明顯降低。由于NS5A蛋白與HCV的復制密切相關，以上研究表明m6A相關的酶系統調控HCV感染。研究人員還發現，YTHDF蛋白可以識別HCV RNA，并負調控HCV子代病毒的產生。由于HCV病毒的復制主要位于細胞內的脂質體內，他們利用免疫熒光技術對HCV感染的細胞內的YTHDF蛋白進行了定位，發現HCV感染誘導YTHDF蛋白向脂質體的定位，識別并結合HCV RNA，還在其他黃病毒屬病毒包括登革病毒（DENV2）、黃病毒（YFV）、寨卡病毒（ZIKV）和西尼羅病毒（WNV）中也應用m6A RNA甲基化測序檢測到m6A修飾位點。綜上，本研究發現細胞質內復制的HCV病毒存在m6A修飾，在病毒的生命周期內扮演重要角色，這也為黃病毒屬疫苗的研究提供了新的切入點。
圖3.黃病毒屬病毒m6A RNA修飾調控病毒感染機制
4.Cell Host Microbe：寨卡病毒感染過程中病毒及宿主的m6A RNA甲基化修飾的動態變化
影響因子：14.9，2016.11.9
加州圣地亞哥大學學者發現m6A甲基化不但影響寨卡病毒自身的轉錄，還影響宿主RNA的結構和功能，并闡明了相關作用機制。作者首先應用m6A RNA甲基化測序，檢測到m6A在寨卡病毒中高表達。接著，在293T細胞內利用shRNA敲低甲基轉移酶METTL3和METTL14以及去甲基化酶ALKBH5和FTO后，應用RIP測序和Real-time PCR結合，檢測寨卡病毒體內RNA表達量，以上研究表明m6A相關酶系統調控m6A的甲基化與去甲基化，從而負調控病毒的復制。作者應用敲降技術，敲低YTHDF1-3蛋白的表達，發現任意單獨敲除一種蛋白后，都可促進寨卡病毒的復制，并且敲低YTHDF 2蛋白后，對病毒復制的促進作用最強。為驗證敲降結果，作者構建YTHDF1-3蛋白與pcDNA的重組質粒，分別轉染至293T細胞，發現病毒的復制受到抑制，并且YTHDF 2的抑制作用最強。敲降和過表實驗共同說明，YTHGF 1-3參與了寨卡病毒感染的過程，并且YTHGF 2蛋白作用最顯著。為進一步研究YTHGF 2蛋白作用機制，作者應用WB技術，檢測到YTHGF 2在敲低METTL14或ALKBH5的細胞中高表達，并應用RT-qPCR技術，檢測到敲低ALKBH5后，能顯著促進病毒復制，而METTL14抑制病毒復制，說明ALKBH5通過直接結合YTHGF 2，參與病毒復制過程。總體來說，本研究揭示了受寨卡病毒感染宿主細胞內m6A相關酶的作用機制。
圖4.宿主體內寨卡病毒的作用機制
5. eLIFE：m6A RNA甲基化調控HIV-1病毒感染和Gag蛋白表達
影響因子：7.7，2016.7.2
與加州大學一樣，來自俄亥俄州立大學團隊也研究了HIV-1 RNA m6A修飾與病毒感染和基因表達的關系。作者應用RIP測序和m6A RNA甲基化測序，發現HIV-1感染CD4 Jurkat細胞，CD4 T淋巴細胞或293T細胞后，發現m6A在細胞間的修飾位置相似，主要分布在基因組非編碼區。接著，作者應用CLIP和m6A RNA甲基化測序，檢測過表達HIV-1病毒后，Hela或CD4細胞中YTHDF1-3蛋白的表達量，旨在檢測YTHDF蛋白是否能與病毒的m6A位點結合。結果發現三種YTHDF蛋白都可識別并結合HIV-1 RNA中的m6A修飾位點。那么既然蛋白和位點是能夠結合的，那么它們之間是在何處，在何時，又發揮著何種功能呢？作者接著在人類癌癥細胞系中應用過表達和敲降技術做功能驗證，證實YTHDF蛋白在HIV-1病毒復制過程中發揮負調控作用。并且，抑制蛋白表達后，病毒Gag蛋白的表達明顯抑制，而通過敲降去甲基化酶AlkBH5，FTO或共抑制后，病毒Gag蛋白的表達明顯升高。
圖5. YTHDF蛋白負調控HIV-1病毒表達
6. PLoS Pathogens：m6A RNA甲基化影響不同類型細胞感染Kaposi肉瘤病毒后的調控模式
影響因子：6.6，2018.4.16
伯克利大學Britta團隊首次揭示了感染Kaposi肉瘤病毒（KSHV）后，細胞中m6A的分布情況，發現YTHDF2蛋白在核內發揮作用。作者應用超高液相色譜法，發現受KSHV病毒感染的iSLK 219細胞（是研究病毒裂解細胞的模式細胞），其RNA m6A甲基化位點修飾比對照組高3倍，說明病毒感染細胞可促進m6A甲基化的修飾。作者通過m6A RNA甲基化測序研究病毒裂解宿主細胞期間細胞RNA中m6A的表達量，發現m6A甲基化程度與細胞裂解程度呈成反比。為驗證m6A RNA甲基化測序結果，作者應用RIP測序和Real-time PCR技術檢測一條與抗病毒相關通路上6個基因的結合和表達量，發現該通路的確參與了KSHV病毒的表達，與m6A RNA甲基化轉錄組功能預測的結果一致。作者假設m6A在KSHV病毒生命周期中起關鍵作用。通過siRNA敲低iSLK 219和iSLK BAC 16細胞中METTL3或YTHDF1-3蛋白的表達，使分別其感染正常293T細胞，發現病毒的復制受抑制，并且病毒裂解反式激活因子ORF50也受到了抑制。通過對比兩種細胞的m6A分布，作者發現在iSLK 219細胞中，m6A主要調控前病毒模式，而在iSLK BAC 16細胞中，m6A主要調控后病毒模式。綜上，本研究證實了m6A參與了病毒感染的通路，并且在不同的細胞類型中差異很大。
圖6. KSHV病毒感染iSLK 219細胞檢測m6A RNA修飾實驗步驟
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