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  • 發布時間:2020-07-28 11:02 原文鏈接: 瓊脂糖凝膠電泳和蛋白質分離純化

      脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作為介質的一種電泳方法,其兼具“分子篩”和“電泳的雙重作用。

      瓊脂糖(Agarose)是一種線性多糖聚合物,是從紅色海藻產物瓊脂中提取而來的,當瓊脂糖溶液加熱到沸點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質,其密度是由瓊脂糖的濃度決定的。

      經過化學修飾的低熔點的瓊脂糖,在結構上比較脆弱,因此在較低的溫度下便會熔化,可用于核酸片段的電泳檢測。

      瓊脂糖凝膠電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小,只要核酸不是太小或者太大(超出電泳分離范圍),該方法的可信度非常高。

      瓊脂糖凝膠電泳的原理

      熒光染料檢測核酸的存在

      觀察瓊脂凝膠中核酸的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠(EB)進行染色,所用的熒光染料含有一個可以嵌入核酸的堆積堿基之間的熒光基團,當染料與核酸結毛細管電泳(CE)合后呈現熒光。

      核酸吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料,被結合的染料本身在302nm和366nm有光吸收,這兩種情況下,被吸收的能量可在可見光譜紅橙區的590nm處重新發射出來,因此,當凝膠中含有游離的EB時即可以檢測到DNA和RNA的存在。

      注1:由于EB具有很強的毒性,因此在操作時一定要戴手套,并且最好有專門的區域進行電泳檢測實驗。

      注2:可以使用GoldView染料代替EB,其具有相同的檢測效果,同時毒性要低很多。

      電泳區分核酸大小

      核酸會根據pH不同帶有不同電荷,在電場中受力大小不同,因此跑的速度不同,瓊脂糖凝膠電泳即根據這個原理對核酸進行區分。

      核酸分子在pH高于其等電點的溶液中帶負電荷,在電場中向正極移動。由于核酸的戊糖-磷酸骨架在結構上具有毛細管電泳(CE)重復性,長度相同的核酸鏈幾乎具有等量的凈電荷,因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。

      此外,含有瓊脂糖的凝膠具有網狀結構,物質分子通過時會受到阻力,大分子物質在涌動時受到的阻力大,因此在瓊脂糖凝膠電泳中,帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量,而且還取決于分子大小,這就大大提高了分辨能力。

      在同樣電場的強度下,核酸分子的遷移速度取決于核酸分子本身的大小和構型以及瓊脂糖凝膠的濃度,簡而言之,分子量較大的核酸遷移速度較慢,分子量較小的核酸遷移速度較快,這就是應用凝膠電泳技術分離核酸片段的基本原理。

      蛋白質是生物體的主要組成物質及生命活動的基礎,蛋白分離和純化是生物化學研究中的一項重要工作,蛋白分離公司可以選擇適當的分離純化程序來獲得高純度的蛋白質制品。毛細管電泳法是經典電泳技毛細管電泳(CE)術與現代微柱分離技術的完美結合,使分離科學進入納升水平,常用于蛋白質的分離和純化,具有高效、快速、微量、靈敏度高、實驗經濟、應用面廣等特點。

      在外電場的作用下,帶電顆粒向著與其所帶凈電荷相反的電極移動的現象成為電泳,電泳法是根據蛋白質的電荷不同分離蛋白質混合物的方法。蛋白質在電場中移動的速度和方向,取決于它所帶電荷的性質、數目、分子質量大小和形狀等,帶電少、分子質量大的蛋白質泳動的速度慢。

      反之,泳動速度快,因此混合在一起的蛋白質按照各自的帶電特點,移動不同的距離從而得以分離。電泳結束后,用蛋白質顯色劑顯色,毛細管電泳(CE)可以看到一條條被分離的蛋白質條帶。毛細管電泳法是兼具電泳和色譜技術的雙重優點,廣泛包含在一些蛋白分離公司的服務中它是一類以毛細管為分離通道,以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。

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