瑕瑜：用化學反應的靈感改造質譜解決脂質組學的難題

　　質譜在現代科學研究中正發揮著日益重要的作用。分析化學家使用質譜，研究基礎科學和應用技術領域的挑戰性課題，做出有影響力的工作。隨著社會與經濟的迅猛發展，科學儀器研發與應用研究從未像今天這樣如此緊密地聯系在一起。對質譜而言，儀器研發、分析方法與應用研究正成為相互推動、共同發展的有機整體。質譜儀器或關鍵部件的研發常常會引領一個全新的應用領域，而質譜分析方法學上的創新也會導致全新分析裝置與流程的產生，從而系統解決已有分析方法面臨的問題。近期，清華大學瑕瑜教授將光化學反應與LC-MS完美結合，首次實現了復雜生物體系中碳碳雙鍵（C=C）位置異構體的大規模、精確結構鑒定與定量，解決了脂質組學研究中長期未能解決的關鍵性問題，并開發了自動化數據處理軟件及分析流程。不久前，分析測試百科網記者采訪了瑕瑜教授，聽她詳解這一重要工作。作為留學歸國的學者、質譜的用戶，她對使用布魯克timsTOF以及質譜儀器本身的發展也有真知灼見，希望對所有關注質譜及其應用的讀者有所啟發……

清華大學瑕瑜教授

發明PB反應裝置和流程

　　“我的研究方向是生物質譜，以發展新的質譜研究方法為手段，對生物分子特別是其同分異構體進行定性定量。” 瑕瑜首先簡要介紹了自己的研究工作。

　　比如，由于細胞中有多種脂質合成代謝路徑，脂質分子常出現C=C雙鍵位置異構體。這類脂質異構體具有相同的質量，但卻承擔著不同的功能。如何在不飽和脂質中有效定位C=C雙鍵并對C=C位置異構體做定量是一個難題。目前，商業質譜儀器所配備的MS/MS方法（碰撞誘導裂解，CID）難以產生和雙鍵相關的碎片離子。因此，大部分脂質組學研究僅能完成脂肪酰水平下的鑒定，無法定位及區別C=C雙鍵的位置及相應的脂質C=C異構體。

　　瑕瑜課題組根據其開展的溶液自由基化學的研究基礎，通過將光化學反應——Paternò-Büchi（PB）反應，將脂質分子中的C=C鍵選擇性衍生化。PB 反應產物在CID條件下可高效生成與雙鍵位置相關的碎片離子。這種方法能夠識別多種不飽和脂肪酸和其它含不飽和脂肪酰基的復合脂質。對大鼠、小鼠等嚙齒動物的組織分析顯示，腫瘤組織中某些同分異構體水平升高，意味著這項技術有可能應用于生物醫學領域。

　　注：PB反應是羰基化合物與烯烴的[2+2]光環化加成反應，該反應從50年代初建立，利用其特殊的區域及立體選擇性可以合成一些結構精巧的取代氧雜環丁烷。

　　當PB反應的產物離子化時，由于衍生化所產生的四元環張力較大，導致衍生產物很容易在C=C位置裂解。采用PB-MS/MS這一方法，只需要通過常規質譜的低能CID功能即可實現脂質分析與定量。這種方法的分析流程非常簡單，便于操作：實驗裝置僅需一個紫外燈（254 nm），電噴霧電離（ESI）管路以及作為ESI溶劑的丙酮。

雙鍵衍生與質譜分析在線聯用，實現脂質雙鍵位置鑒定

　　該光化學反應與常規LC-MS結合后形成的整套分析流程包括液相色譜分離方法、數據收集、結構解析和配套的質譜數據處理軟件（Lipid Omega Analyzer，LOA）。利用這項技術，瑕瑜教授課題組揭示了牛肝臟中200多種不飽和甘油磷脂的C=C位置，并鑒定出55組C=C位置異構體。通過對乳腺癌患者和2型糖尿病患者血漿樣本的分析，發現C=C同分異構體的比例受個體豐度的影響較小，表明同分異構體組成有成為脂類生物標志物的潛力。不久前，該工作發表在《自然.通訊》上。

PB脂質分析法誕生的靈感和未來前景

　　瑕瑜表示：將PB反應用于雙鍵衍生是個偶然，此前課題組一直關注的是自由基和雙硫鍵（S-S）的反應。自 2013年起，課題組才啟動自由基和碳碳雙鍵反應方面的研究。當時在普渡進行博士后研究的馬瀟瀟老師發現在254 nm紫外輻射下丙酮可與脂質中的C=C發生環化，形成氧雜環丁烷四元環隨后，該反應在脂質C=C定位上的潛力被迅速挖掘，最終發表在以他為第一作者的2014年《德國應用化學》上。以此為基礎，課題組后續又發展出了脂質C=C異構體的定量分析方法，用于小鼠乳腺癌腫瘤組織中脂質異構體組成的分析，并發現其有潛力作為腫瘤的生物標記物。目前，馬瀟瀟老師在清華大學精儀系擔任助理教授。最近他還獨立發展了其它的衍生化反應，利用單一方法實現了包括C=C及sn位置等的脂質全面結構鑒定與定量，在血漿、細胞和疾病組織的生物醫學分析上獲得了很好的效果，工作很出色。

　　發現PB反應是偶然，但給我們很好的啟示：我們用原有的質譜方法（如CID）無法有效碎裂、無法獲取足夠的結構信息，在結合有效的化學衍生后，可以解決以前的分析手段難以解決的問題。這也提示了在組學研究中，我們可能忽視了很多經典的化學反應：如果把它們應用于解決分析化學領域的問題，極有可能會發揮出巨大的威力。

　　對于脂質結構的鑒定，比如鑒定異構體或精細結構，除PB反應還有其它一些值得關注的方法，比如位于澳大利亞布里斯班的昆士蘭科技大學的Stephen Blanksby教授。Blanksby教授利用臭氧誘導解離(OzID)，在質譜儀的離子阱里以臭氧切斷碳碳雙鍵。清華大學張新榮、馬瀟瀟和歐陽證教授合作，發現基于低溫等離子體(LTP)技術的環氧化反應也可實現不飽和脂質的高效結構解析。

　　PB反應耦合LC-MS已形成脂質組學研究的完整工具【1】

在C=C位置水平上鑒定脂質的LC-PB-MS/MS系統原理圖。a 關鍵組件包括：用液相色譜分離脂質，HILIC色譜柱，用丙酮/ACN/NH4Ac （10 mM） 溶液作流動相；由FEP管制成的流動微反應器和低壓汞燈（254 nm 發射波長），用于與 LC 和 ESI-MS 在線耦合，不飽和GPs的PB反應產物在CID碰撞后形成C=C診斷離子。b 分析工作流程包括：兩次傳統的LC-MS/MS，用于在脂肪酰水平下的鑒定；一次LC-PB-MS/MS實驗，采用數據依賴方式采集，在C=C位置水平下鑒定脂質。數據分析使用自助開發的程序：Lipid Omega Analyzer

　　瑕瑜教授介紹到目前PB反應相對于其它的脂質雙鍵定位技術有幾個優勢。首先， PB反應發生在質譜外，可以在一分鐘之內對上百種脂質分子進行衍生，然后用串聯質譜逐一分析，因此分析通量高。其次，PB反應使用方便，無需對質譜儀器進行改造，有利于更多人來使用并發展它。另外，PB反應裝置可以與傳統的LC-MS在線聯用，有利實現高通量的樣品自動分析。我們和歐陽證教授合作【2】，不僅實現了與LC-MS的聯用，還發展了脂質的從頭測序結構分析工具（de novo structure analysis），用于數據采集和自動數據分析。目前為止，其它脂質精細結構鑒定的方法尚停留在研究結果的展示階段，還沒有編制工具包。我們先行一步，同時也向同行表明這是可行的方案。

清華吸引了普渡的一對學者伉儷

　　中國的強大不斷吸引著優秀人才回國，談到此，瑕瑜非常高興：“清華大學化學系享譽國內外，有強大的師資、設備及后勤系統支撐最前沿的科學研究。我非常幸運能加入清華大學化學系。”那為何選擇清華大學？瑕瑜坦率回答：“我的先生歐陽證此前已經在清華大學開始工作。由于我們在普渡大學已經有比較緊密的合作，繼續在同一所學校對之后的合作會有地域優勢。所以非常感謝清華大學化學系給了我這份職位。”

　　回到清華后，瑕瑜繼續開展自己從2009年就開始的研究。這項研究從基礎的自由基化學開始，發展質譜裝置，解決當前面臨的脂質組學和蛋白質組學的挑戰性問題。2019年發表《自然·通訊》文章，其實建立在從2009年開始的工作基礎上，開始6、7年主要是從事基礎研究，在基礎研究方面獲得突破后，才形成了在整個技術、以及在組學上的突破。

為什么選擇timsTOF？

　　布魯克推出timsTOF，瑕瑜課題組是國內最早的用戶之一。談到這次合作，瑕瑜表示：離子淌度和質譜連接具有提供多維度分析信息和高通量分析的獨特優勢。我的興趣是生物分子異構體的結構鑒定，因此自然就想到把現有的結構分析的方法和離子淌度結合起來，解決異構體的問題。當時了解了市場上幾種離子淌度質譜儀，選擇了timsTOF這種具有離子富集功能的儀器。首先，它和我們今后想進行的儀器改進很匹配，有很多靈活性。分離的原理是通過管狀（tube）的離子淌度分析器（體積很小）施加捕集電壓和氣體，把離子捕集在淌度裝置中。此時離子會按照不同的碰撞截面積排列，隨后通過改變捕集電壓，逐個將離子從大到小地分離出來。TimsTOF也是當時市場上分離效率最高的質譜（淌度分辨率200）。

timsTOF

　　其次，由于timsTOF可以儲存離子，因此可以在氣相中對離子進行多種操作，例如富集低濃度的成分，或者作為反應器研究氣相自由基化學。整體而言，timsTOF儀器特點與課題組今后的研究規劃高度一致。除脂質外，我們還在開展利用timsTOF平臺表征多肽及蛋白二硫鍵連接異構體、脂質-蛋白的復合物等一系列課題。除了timsTOF外，我們團隊還購置了一臺Bruker Impact Q-TOF質譜儀做儀器改造。 通過安裝波長可調的激光器（200 ~700 nm），在原有碰撞池里實現了紫外光裂解（UVPD）的功能。

正在改裝中的Impact

　　目前，利用timsTOF已經實現了對含共軛C=C亞油酸的分析，該工作以謝小波博士為第一作者近期發表在《Analytical Chemistry》【3】上。根據之前的報道，丙酮作為衍生試劑與雙鍵發生【2+2】環加成反應，可生成兩種PB加成產物（即丙酮的氧原子可分別加在雙鍵兩個碳原子上）；兩種PB產物經串聯質譜分析，可得到一對含醛（F_A）和烯烴（F_O）的診斷離子。謝小波博士發現，與非共軛脂質相比，共軛脂肪酸的PB光化學衍生具有高區域選擇性（氧原子均加在共軛體系兩端的碳原子上，而非每個C=C的碳原子上）；同時，在PB-MS/MS質譜圖中，共軛脂肪酸得到診斷離子信號明顯高于其非共軛異構體。結合布魯克公司2016年推出的高分辨捕集離子淌度技術（trapped ion mobility spectrometry, TIMS），可確定雙鍵Z/E構型（如下圖所示）。離子淌度數據表明，共軛亞油酸的兩個C=C構型在光化學衍生過程中會發生異構化，得到四種構型CLA異構體，并在離子淌度上被分開成兩個峰（Z,Z vs E,E和Z,E vs E,Z）。隨后，通過引入銀離子，與雙鍵配位形成CLA復合物，各構型異構體之間的結構差異進一步增大并可在TIMS上完全分開。相比于傳統方法，該方法具有操作簡單、分析速度快（< 1 min）和樣品用量少等優點。

PB-MS/MS與TIMS聯用分析共軛脂肪酸異構體

　　談到最新的timsTOF Pro，瑕瑜表示：它大大提高了MS/MS掃描頻率和離子利用率，MS/MS掃描頻率可達100 Hz以上；而且它采用雙離子淌度設計，第一個淌度做富集，第二個淌度做分離，兩個淌度串聯的設計將離子利用率提高至近100%，因此靈敏度、鑒定深度又得到大幅提高。所以對組學鑒定，不管是蛋白組學還是脂質組學都非常有好處，今后脂質組學的很多方法學都可展示在timsTOF Pro上。

脂質生物分析與小型質譜

　　除了和世界知名的儀器公司合作，瑕瑜和歐陽證教授合作開發了基于miniβ小型化質譜儀器的脂質鑒定研究。瑕瑜表示：“小型質譜體積小噪音低，可能進到手術室或者藥店做現場預前診斷。我們在大型質譜儀器上的工作表明：脂質異構體組成和疾病有相關性，而這同小型儀器的特點和應用契合。PB反應和質譜聯用的優點是不依賴內標就可在一張譜圖上直接測量異構體的相對比例，個體誤差僅在15%左右。以異構體的比例作為疾病的潛在標志物，可極大簡化實驗步驟，縮短檢測時間。以上實驗可以通過miniβ小質譜配合PB 反應試劑盒來實現。 因此小質譜結合脂質C=C雙鍵位置異構體的測定，是一種雙贏的結合。”

　　此外，在LC-MS/MS聯用方面，清譜和瑕瑜的課題組合作設計了用于PB反應的Ω 反應器和Lipid Ω analyzer數據包。

耦合LC-MS/MS的Ω反應器

對質譜儀器廠家的建議

　　談到對質譜儀器廠家的建議，瑕瑜表示：對比來看，由于質譜的主要生產廠家在美國和歐洲，西方國家工業界的技術人員與學者間的聯系更加緊密，合作也更加容易。比如我課題組正在開展的氣相離子化學研究需要對質譜儀器做改造，這在美國比較容易，而在中國就比較困難。儀器研發與應用間的良好互動對推動整個科學儀器行業良性、健康發展有著積極意義。希望國內質譜儀器公司加強這方面的工作，提供必要的資源和條件，強化對技術人員的培訓，實現工業界質譜儀器研發與學術界基礎和應用研究間的實質性合作。談到在美國大學實驗室和質譜儀器公司的合作，瑕瑜也分享了自己的一些體會。不同的公司有不同的策略，有些公司的合作項目主要集中在跟自己的市場戰略緊密相關的課題上；有些公司的合作項目則主要關注自己當前不做的、比較前沿、但有長遠意義的項目。合作會比較緊密，合作時間甚至會長達十幾年。

對中國質譜研發的建議：重視人 重視分析化學

　　談到對中國質譜研發制造的建議，瑕瑜認為最重要的一環是人。技術的復制相對簡單，但要做創新、有實用價值的技術，需要研究人員有獨特的想法和切入點。我國現階段受過專業質譜訓練的人相對較少，國外的幾家大型的質譜儀器公司每年在質譜研究處于前沿地位的大學（例如普渡大學、威斯康星-麥迪遜分校、UIUC等）都大量招博士、博后。這些學校都有多位教授從事與質譜儀器和應用相關的科研，包含了從儀器研發、氣相化學、質譜成像、到后端的數據處理等各個方面。他們培養出的博士從理論深度、對學科前沿的把握、到解決實際問題的能力都很出色。因此從國家到學校層面，在引進人才、后續考評、基金等方面加強對質譜領域研究者的支持，對優化質譜研發的生態尤為重要。

　　最后，談到近年來國家經費對儀器設備采購的支持時瑕瑜表示：因為諸多質譜界等科學儀器行業同仁的共同努力，國家通過設立儀器研發專項大幅增加了對儀器研發的支持力度。這必將助力中國質譜研發隊伍的壯大發展，對我國早日成為科學儀器強國也將發揮積極作用。

　　人物簡介：

　　瑕瑜教授：1999年獲蘭州大學學士，2002年獲中科院上海藥物研究所碩士，2006年獲得美國普渡大學化學系博士學位。2007-2009年于普渡大學分別擔任博士后和助理研究員的工作。自2009年秋開始，在普度大學化學系擔任助理教授并于2015年擔任副教授。2016年起任清華化學系教授。瑕瑜教授致力于研究生物大分子氣相離子化學和質譜儀器的開發及應用。其團隊發展了質譜研究自由基-生物大分子反應的方法，對進一步推動質譜在蛋白、多糖、脂質結構解析的能力上做出了貢獻。瑕瑜教授在本領域重要期刊發表論文80余篇， 包括《美國國家科學院院刊》，《美國化學學會志》，《德國應用化學》，《自然·通訊》，《分析化學》等。

　　參考文獻：

　　1.Online photochemical derivatization enables comprehensive mass spectrometric analysis of unsaturated phospholipid isomers. Wenpeng Zhang, Donghui Zhang, Qinhua Chen, Junhan Wu, Zheng Ouyang & Yu Xia. Nature Communications volume 10, number: 79 (2019)

　　2.PB反應結緣小型質譜，脂質組學研究再添利器，分析測試百科網

　　https://www.antpedia.com/news/96/n-1449696.html

　　3.Analysis of Conjugated Fatty Acid Isomers by the Paternò-Büchi Reaction and Trapped Ion Mobility Mass Spectrometry, Xiaobo Xie, Yu Xia, Analytical Chemistry 2019, 91, 11, 7173-7180