人體可利用甘油、糖、脂肪酸和甘油一酯為原料，經過磷脂酸途徑和甘油一酯途徑合成甘油三酯。
1. 甘油一酯途徑
以甘油一酯為起始物，與脂酰CoA共同在脂酰轉移酶作用下酯化生成甘油三酯。
2. 磷脂酸途徑
磷脂酸即3磷酸-1,2-甘油二酯，是合成含甘油脂類的共同前體。糖酵解的中間產物類磷酸二羥丙酮在甘油磷酸脫氫酶作用下，還原生成α-磷酸甘油(或稱3-磷酸甘油)；游離的甘油也可經甘油激酶催化，生成α-磷酸甘油(因脂肪及肌肉組織缺乏甘油激酶，故不能利用激離的甘油)。α-磷酸甘油在脂酰轉移酶(acyl transferase)作用下，與兩分子脂酰CoA反應生成3-磷酸。1,2甘油二酯即磷脂酸(phosphatidic acid)。此外，磷酸二羥丙酮也可不轉為α-磷酸甘油，而是先酯化，后還原生成溶血磷脂酸，然后再經酯化合成磷脂酸。
磷脂酸在磷脂酸磷酸酶作用下，水解釋放出無機磷酸，而轉變為甘油二酯，它是甘油三酯的前身物，只需酯化即可生成甘油三酯。
甘油三酯所含的三個脂肪酸可以是相同的或不同的，可為飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。
甘油三酯的合成速度可以受激素的影響而改變，如胰島素可促進糖轉變為甘油三酯。由于胰島素分泌不足或作用失效所致的糖尿病患者，不僅不能很好利用葡萄糖，而且葡萄糖或某些氨基酸也不能用于合成脂肪酸，而表現為脂肪的氧化速度增加，酮體生成過多，其結果是患者體重下降。此外，胰高血糖素、腎上腺皮質激素等也影響甘油三酯的合成。