生物大分子制備的前處理
生物大分子制備的前處理(生物材料的選擇、細胞破碎、生物大分子的提取）
1 生物材料的選擇
制備生物大分子，首先要選擇適當的生物材料。材料的來源無非是動物、植物和微生物及其代謝產物。從工業生產角度選擇材料，應選擇含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低的原料，但往往這幾方面的要求不能同時具備，含量豐富但來源困難，或含量來源較理想，但材料的分離純化方法繁瑣，流程很長，反倒不如含量低些但易于獲得純品的材料，由此可見，必須根據具體情況，抓住主要矛盾決定取舍。從科研工作的角度選材，則只須考慮材料的選擇符合實驗預定的目標要求即可。除此之外，選材還應注意植物的季節性、地理位置和生長環境等。選動物材料時要注意其年齡、性別、營養狀況、遺傳素質和生理狀態等。動物在饑餓時，脂類和糖類含量相對減少，有利于生物大分子的提取分離。選微生物材料時要注意菌種的代數和培養基成分等之間的差異，例如在微生物的對數期，酶和核酸的含量較高，可獲得較高的產量。
材料選定后要盡可能保持新鮮，盡快加工處理，動物組織要先除去結締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當的溶劑中提取，如果所要求的成分在細胞內，則要先破碎細胞。植物要先去殼、除脂。微生物材料要及時將菌體與發酵液分開。生物材料如暫不提取，應冰凍保存。動物材料則需深度冷凍保存。
2. 細胞的破碎
除了某些細胞外的多肽激素和某些蛋白質與酶以外，對于細胞內或多細胞生物組織中的各種生物大分子的分離純化，都需要事先將細胞和組織破碎，使生物大分子充分釋放到溶液中，并不丟失生物活性。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要采取專門的細胞破碎方法。
(1)機械法：
1) 研磨：將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿，即可將動物細胞破碎，這種方法比較溫和，適宜實驗室使用。工業生產中可用電磨研磨。細菌和植物組織細胞的破碎也可用此法。
2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通常可先用家用食品加工機將組織打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的內刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎，為了防止發熱和升溫過高，通常是轉10秒～20秒，停10秒～20秒，可反復多次。
(2)物理法：
1) 反復凍融法：將待破碎的細胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復凍融多次，由于細胞內形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。
2) 超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些，處理的效果與樣品濃度和使用頻率有關。使用時注意降溫，防止過熱。
3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高壓下使幾十毫升的細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。這是一種較理想的破碎細胞的方法，但儀器費用較高。
4) 冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此法。在90℃左右維持數分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎。
(3)化學與生物化學方法：
1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當的溫度下，細胞結構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發生溶解，使細胞內含物釋放出來，此法稱為自溶法。使用時要特別小心操作，因為水解酶不僅可以使細胞壁和膜破壞，同時也可能會把某些要提取的有效成分分解了。
2) 溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內含物。
3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細胞壁分解，釋放出細胞內含物，此法適用于多種微生物。例如從某些細菌細胞提取質粒DNA時，可采用溶菌酶（來自蛋清）破細胞壁，而在破酵母細胞時，常采用蝸牛酶（來自蝸牛），將酵母細胞懸于0.1mmol/L 檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液(pH=5.4)中，加1％蝸牛酶，在30℃處理30分鐘，即可使大部分細胞壁破裂，如同時加入0.2％疏基乙醇效果會更好。此法可以與研磨法聯合使用。
4) 有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法聯合使用。
3 生物大分子的提取
" 提取"是在分離純化之前將經過預處理或破碎的細胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態不丟失生物活性的過程。這一過程是將目的產物與細胞中其他化合物和生物大分子分離，即由固相轉入液相，或從細胞內的生理狀況轉入外界特定的溶液中。
影響提取的因素主要有：目的產物在提取的溶劑中溶解度的大小；由固相擴散到液相的難易；溶劑的pH值和提取時間等。一種物質在某一溶劑中溶解度的大小與該物質的分子結構及使用的溶劑的理化性質有關。一般地說，極性物質易溶于極性溶劑，非極性物質易溶于非極性溶劑；堿性物質易溶于酸性溶劑，酸性物質易溶于堿性溶劑；溫度升高，溶解度加大，遠離等電點的pH值，溶解度增加。提取時所選擇的條件應有利于目的產物溶解度的增加和保持其生物活性。
⑴ 水溶液提取：
蛋白質和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質的穩定性好，溶解度大，是提取蛋白質和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應注意的幾個主要影響因素是：
1) 鹽濃度（即離子強度）：離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質，如DNA-蛋白復合物，在高離子強度下溶解度增加，而另一些物質，如RNA-蛋白復合物，在低離子強度下溶解度增加，在高離子強度下溶解度減小。絕大多數蛋白質和酶，在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質的溶解度比在純水時大大增加，稱為"鹽溶"現象。但中性鹽的濃度增加至一定時，蛋白質的溶解度又逐漸下降，直至沉淀析出，稱為"鹽析"現象。鹽溶現象的產生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力，增加了溶質和溶劑分子間相互作用力的結果。所以低鹽溶液常用于大多數生化物質的提取。通常使用0.02 mol/L ～0.05 mol/L 緩沖液或0.09 mol/L ～0.15 mol/L NaCl 溶液提取蛋白質和酶。不同的蛋白質極性大小不同，為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性。
2) pH值：蛋白質、酶與核酸的溶解度和穩定性與pH值有關。過酸、過堿均應盡量避免，一般控制在pH=6～8范圍內，提取溶劑的pH應在蛋白質和酶的穩定范圍內，通常選擇偏離等電點的兩側。堿性蛋白質選在偏酸一側，酸性蛋白質選在偏堿的一側，以增加蛋白質的溶解度，提高提取效果。例如胰蛋白酶為堿性蛋白質，常用稀酸提取，而肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質，則常用稀堿來提取。
3) 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質和酶，提取時一般在0℃～5℃的低溫操作。但少數對溫度耐受力強的蛋白質和酶，可提高溫度使雜蛋白變性，有利于提取和下一步的純化。
4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：在提取蛋白質、酶和核酸時，常常受自身存在的蛋白酶或核酸酶的降解作用而導致實驗的失敗。為防止這一現象的發生，常常采用加入抑制劑或調節提取液的pH、離子強度或極性等方法使這些水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質、酶及核酸的降解作用。例如在提取DNA時加入EDTA絡合DNAase活化所必須的Mg++。
5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質的變性失活。因為一般蛋白質都含有相當數量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內或分子間的二硫鍵，導致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。
⑵ 有機溶劑提取
一些和脂類結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機溶劑提取。常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親脂性，其中正丁醇在0℃時在水中的溶解度為10.5％，40℃時為6.6％，同時又用具有較強的親脂性，因此常用來提取與脂結合較牢或含非極性側鏈較多的蛋白質、酶和脂類。例如植物種子中的玉蜀黍蛋白、麩蛋白，常用70％～80％的乙醇提取，動物組織中一些線粒體及微粒上的酶常用丁醇提取。
有些蛋白質和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機溶液提取常常可以防止水解酶的破壞，并兼有除去雜質提高純化效果的作用。例如，胰島素可溶于稀酸、稀堿和稀醇溶液，但在組織中與其共存的糜蛋白酶對胰島素有極高的水解活性，因而采用6.8％乙醇溶液并用草酸調溶液的pH為2.5～3.0，進行提取，這樣就從下面三個方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：①6.8％的乙醇可以使糜蛋白酶暫時失活；②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++；③選用pH2.5～3.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。以上條件對胰島素的溶解和穩定性都沒有影響，卻可除去一部分在稀醇與稀酸中不溶解的雜蛋白。