生物芯片及其在基因體研究上的應用

生物芯片概論

DNA分子在大多數生物體中是以雙股的型態存在(少數病毒、噬菌體除外)。在某些特殊生理狀態下，例如：細胞分裂、基因表現等，雙股DNA會解開變成單股，然后再回復成雙股。而生物學家很早就把這單股DNA利用氫鍵結合成雙股DNA分子的特性應用在生物相關的研究，稱之為雜合反應(Hybridization)。從1965年，Gillespie和piegelman發表利用雜合反應篩選重組菌株后，有許多的實驗技術，包括南方墨點(Southern blot)、北方墨點(Northern blot)、原位雜合(in situ Hybridization)、DNA序列分析(DNA Sequencing)、PCR (Polymerase Chain Reaction) 甚至目前熱門的生物芯片(DNA芯片)，無一不是利用核酸雜合反應的原理。從這個歷史的演進，也可看出生物芯片在基因體研究上的多元潛力。

生物芯片是先將已知有興趣的單股DNA分子，稱為探針DNA (probe DNA)，利用化學共價結合或物理性吸附，固定在耐侖膜(nylon membrane)、玻璃或其它固態載體上。再利用一些實驗技術從細胞或細菌復制、放大有興趣的基因或DNA片段，稱之為標的DNA(target DNA)，并以熒光物質標定(label)。標的DNA和芯片上的探針DNA進行雜合反應后，若此細胞或細菌有表現植入芯片上的基因或DNA片段，就可在掃描儀上偵測到熒光亮點，我們就可以知道哪些基因有表現，哪些基因沒有表現。從植入芯片上的探針DNA不同，可以分成兩大類：一類是將單股cDNA
(complementary DNA)植入芯片，稱為cDNA芯片；另一類是把寡核甘酸序列(oligonucleotide)植入芯片，稱之為寡核甘酸芯片(oligo chip)。這兩類生物芯片性質不同，適用于不同的基因體研究，并且擴展了生物芯片應用的范圍。

生物芯片在基因體研究上的應用

微小化并能同時快速大量的處理樣品是生物芯片最大的優點，目前應用生物芯片研究的領域很廣，如：基因表現、發現新基因、癌癥分類、新藥開發、單一核甘酸多型性(SNP, single nucleotide polymorphism)等。

1.基因表現

在生物芯片發展之前，大部分的研究者都僅局限在研究一個或數個基因的表現，這對于復雜的生物系統來說，無異是以管窺天。利用生物芯片，我們可以同時監看上百種甚至上千種基因的表現。Affymetrix公司所推出Human
Genome U95 Set 包含了6000個以上的人類基因和EST片段，幾乎含蓋了所有人類的基因，利用此種生物芯片，可使我們對于生物體整個反應機制及訊號傳遞(signal transduction)有較完整的了解。

以癌癥為例，癌癥一直是人類十大死因之首。對于生物學家而言，它也是一個有趣而復雜的課題，為什么有些人會得癌癥？有些不會？是什么原因造成一個正常細胞開始毫無約束的不斷分裂？雖然目前已找到一些抑癌基因(tumor suppressor gene)和致癌基因(oncogene)。但癌癥是由許多因素加在一起所造成的結果，我們很難斷定什么致癌物一定會引起癌癥，由于它牽涉許多基因的交互作用，因此至今連發生的原因都不甚明了，更遑論治療了。生物芯片提供了一個很好的工具，告訴我們癌細胞和一個正常細胞到底有何不同。如我們從正常細胞抽取其mRNA(messenger RNA)以反轉錄脢(reverse transcriptase)制造其互補DNA(cDNA)并用綠色熒光物質標定；同樣地，從癌細胞抽出之mRNA制造其cDNA后，以紅色熒光物質標定，將此兩種標的DNA(此指cDNA)混合在同一芯片上做雜合反應，正常細胞表現較多的基因呈現綠點，而癌細胞表現較多的基因呈現紅點，正常細胞和癌細胞表現相同的基因則呈現黃點。由此即可知道哪些基因在癌細胞中大量表現。此例中，ErbB2基因呈現紅點，表示在乳癌細胞中此基因大量表現。

利用此種方法可應用在其它各種不同的研究領域，例如：Lockhart利用含有65000個寡核甘酸探針的生物芯片，分析老鼠T細胞中114個基因。發現在細胞激素(cytokine)的誘導下，有20種基因表現受到影響。Kevin等人利用6240個不同基因和EST片段的生物芯片，研究和果蠅蛻變(metamorphosis)有關的基因。Joseph利用含有6400個DNA片段的生物芯片，研究酵母菌從呼吸作用轉變成發酵作用其中有關代謝的基因表現，當葡萄糖在培養液中逐漸減少時，大約有710個基因被誘發表現，1030個基因產物減少。

2.新基因的發現

由上可知，不論是癌細胞的表現、刺激T細胞的反應、果蠅發育、或是代謝途徑的改變。這些生理現象都被復雜的基因所調控，牽涉到許多基因。以人類約有100000個基因來估算，我們知道其功能的基因不及5％，而真正知道其作用機制的，更是屈指可數。點在芯片上的探針DNA，有很多是我們還不清楚功能的，但當我們去看整個細胞的基因表現時，我們就可對那些功能不明，但被促進表現或抑制表現的一些基因做深入的研究，并推測它是參與那一條訊號傳遞路徑(pathway)。以Joseph研究酵母菌代謝的實驗為例，就發現了超過400個新的基因作用其中。

3.癌癥的分類

傳統上，病理學家依腫瘤的型態學加以分類，但此種分類法對于那些組織病理學相似，但病程和愈后迥異的癌癥無法有效地區分。現在科學家可利用生物芯片來分類癌癥，分子診斷不但能準確地區分相似的癌癥，同時也讓我們對于腫瘤的分子機制有更進一步的認識。

Golub在1999年科學雜志(Science)發表利用生物芯片來區分Acute Myeloid Leukemia(AML)和Acute
Lymphoblastic Leukemia (ALL)。這兩種血癌(Leukemia)在顯微鏡下型態很相似，但卻需要完全不同的化學療程。首先他們用6800個基因的芯片檢視38個病人(其中27個被診斷為ALL而另11人則為AML)，然后鎖定了其中50個基因，這些基因包括了細胞表面抗原(cell surface antigen)、細胞周期蛋白(cell cycle protein)、細胞聯系蛋白(cell adhesion protein)和一些酵素。這50個基因明顯地在AML和ALL中表現不同 。因此可用以區分AML和ALL。以生物芯片檢測癌癥不但是在癌癥診斷學上的重大突破，同時也對癌癥治療、抑癌藥物的開發等有重大的影響。

4.新藥開發

開發新藥的一般策略是找到和疾病有專一性的細胞標的物(通常是蛋白質)，然后再篩選能抑制或競爭此蛋白質的分子—可能是蛋白質、核酸或是有機化合物等。然而這個方法受限于只能篩選已知的細胞標的物，而生物芯片可以加速確認疾病的專一性細胞標的物，并顯示其病理學的作用途徑。這些發現均能立即用在新藥的開發上。例如：Her-2/neu在乳癌細胞中大量表現，它就有潛力成為新藥的標的物，換句話說，我們可以找一些抑制Her-2/neu表現的分子—即為新藥。此外，開發中的新藥也可利用生物芯片來了解它的作用機制。


5.單一核甘酸多型性(SNP)

雖然同種生物其染色體差異極小，但平均1000個堿基對 (base pair)就有一個發生突變，這些變異稱為SNP，是造成每個人對藥物的敏感性不同、血型不同等的原因。此外，SNP也和癌癥、心血管疾病、自體免疫、糖尿病及阿茲罕默癥等疾病有關，甚至于微生物的抗藥性。所以SNP現在越來越受到重視，SNP協會，TSC (The SNP Consortium)，于1999年4月打算花4,500萬美金在兩年內找出300,000種SNP，并建立數據庫。

最近很多研究者想利用高密度的生物芯片來鑒別人類的SNP，Patrick等人則利用可通電流的半導體生物芯片來分辨人類甘露醣結合蛋白(Human Mannose Binding Protein，MBP)的SNP。MBP對于先天性免疫系統很重要，尤其是對于那些尚未發育完整免疫系統的兒童。此外，Affymetrix公司也發展出p53 GeneChip，藉由設計一組含5種不同堿基序列的探針DNA，它能偵測出腫瘤抑制基因p53在特殊區域中，堿基序列的SNP(出現A或G)，如圖3.；HIV GeneChip則能偵測出HIV-1 Protease的變異。

未來21世紀最重要的生醫研究工具

由美國主導的人類基因體計劃(Human Genome Project)預計將在2003年解出人類所有23對染色體DNA序列，估計約有100000個基因，三億個堿基對。工程之浩大，與1969年阿波羅登月計劃同為近代人類偉大的成就之一。因為人類自350萬年前演化至今，將第一次完整知道自己所攜帶的遺傳密碼，尤其是對于疾病的了解將有突破性的發展。除了人類基因體計劃之外，目前已解出染色體DNA序列的生物超過了600種，包括了細菌、病毒、真核生物(果蠅、線蟲、阿拉伯芥等)。每天都有新的DNA序列被解出，如此龐大的DNA序列對于我們而言，它猶如一本由A、T、G、C四個字母組成的天書，至于其內部所隱含的意義，就要靠生物信息學把它譯碼成我們看得懂得“基因”，更進一步，則需要生物芯片告訴我們基因在整個生物體內生理、病理或藥理作用的調控，使我們對于生物有整個巨觀的認識。

結語

生物芯片無疑的將在下一世紀成為最重要的生物醫學研究工具，對于我們目前所知的基因調控、新藥開發、疾病分類、及疾病診斷等，都將掀起重大的革命性影響。