2 結果與討論
2.1 PCR模板DNA的快速制備
本方法是將少量植物葉片在TE溶液或去離子水中，經鎢合金珠在離心管內的振蕩破碎，直接獲得DNA溶液。用多功能組織細胞研磨器（MTM-60）一次可操作60個樣品。瓊脂糖凝膠電泳表明，用TE和去離子水都可獲得分子量較大的DNA片段（圖1A）。用TE制備的DNA在4℃下可保存10天以上，在冷凍下可保存半年。而用去離子水制備的DNA容易降解，保存時間較短，因此我們采用TE為主。
圖1 本方法制備的水稻和擬南芥基因組DNA。
注：A: 用TE（泳道1～5）和去離子水（泳道6～10）制備的水稻基因組DNA (4～6mg葉片/200μl)。 M為分子量標記。B, C: 用200μl TE制備的不同濃度的水稻（B）和擬南芥（C）基因組DNA。泳道1～3為4～6mg葉片；4～6為12～15mg葉片；7～9為約25～30mg葉片。
2.2 不同量的模板DNA的PCR擴增效果
本方法制備的基因組DNA沒有經過純化，含有各種可能抑制Taq酶活性的雜質。因此，加入過多的粗制DNA可能會影響PCR反應。為了找出適合于PCR反應的DNA量，我們在一定量的TE（200μl）中加入不同量（4～6mg、12～15mg和25～30mg）的水稻和擬南芥葉片制備基因組DNA（圖1，B,
C）。選用2對水稻的引物（PR1、PR2，擴增產物長度分別為540bp和890bp）和1對擬南芥引物（PA, 擴增產物長度為1
kb），取1μl
DNA在20μl的體系進行PCR反應。結果表明，對擴增較小的DNA片段，所有模板都能擴增出產物，但用4～6mg葉片制備的模板DNA獲得最好的擴增效果（圖2A）。對擴增較大的DNA片段，只有用4～6mg葉片制備的模板DNA獲得較穩定的擴增效果（圖2B,
C）。
圖2 不同量的基因組DNA為模板的PCR反應的瓊脂糖凝膠（1％）檢測
注：A，B，C分別為用引物PR1，PR2，和PA進行PCR。在所有反應（20μl）含有1U Taq酶和1μl基因組DNA；泳道1～3，4～6，7～9分別為以4～6mg，12～15mg，和25～30mg葉片在200μl TE中制備的基因組DNA。
本實驗說明，用4～6mg（可以多至約10mg）葉片/200μl TE的比例制備基因組DNA溶液所含的雜質濃度較低，加入1μlDNA溶液到20μl反應體系中不會抑制Taq酶的活性。而加入1μl較高濃度的模板DNA對PCR反應的抑制作用較大。由于模板DNA量較少（約1～2ng/μl），PCR循環數比用較大量的純化DNA模板（一般用20~50ng）的PCR要多些（多3～5個循環）。雖然可以將用較多葉片制備的模板DNA稀釋使用或加入較少量（<1μl）的模板DNA也能獲得好的PCR效果，但從簡化操作步驟，提高工作效率考慮，確定最佳的經驗值對效率化的大規模樣品檢測尤為重要。由于加入的樣品葉片量有一個合適的范圍，在實際操作中，并不需要所有樣品都用天平稱取，以經驗目測估算即可。
2.3用于分子標記的基因型分析
由于用本方法制備的基因組DNA可以PCR擴增出較大的目的片段，對于PCR分子標記，如微衛星（SSR）、插入/缺失（InDel）、單核苷酸多態（SNP）等檢測較短的DNA片段（一般<200bp）應該是可行的。我們用4對位于水稻秈粳雜種花粉不育基因Sc（Yang
et al.,
2008）連鎖區的InDel標記引物（表1）對F2群體進行的基因型分析。圖3顯示了部分結果，所有標記的PCR擴增效果穩定，聚丙烯酰胺凝膠電泳的DNA條帶均清晰易辨。
圖3 用InDel分子標記的水稻基因型檢測
注：A～D分別為用引物L14-121，J04-91，P24-83，和P24-93的PCR。左邊起第1和第2泳道分別為親本E5和T65、其它泳道均為F2個體。
已報道植物基因組DNA制備的方法很多，如經典的SDS法、CTAB法，另外還有一些簡化的制備方法,如SDS一步法（王會文等，2002）、微波爐水煮法（黃小樂等，2002）、TE研磨法（羅文永等，2002）、NaOH處理幼葉直接作為PCR模板法（汪秀峰等，2002）、簡易提取法（陳文岳等，2005）、剪切法（趙紅霞等，2006）。對需要對大量樣品進行基因型分析的研究來說，這些方法的操作效率不夠高，或制備的模板DNA的擴增結果不理想，常常不能擴增出目的片段。本研究提出的DNA制備方法簡單，大大縮短了時間，適合操作大量的樣品，而且PCR效果和重復性好，需要葉片量也很少，所需的儀器（多功能組織細胞研磨器）價格低，因此實驗成本低。我們用本方法已制備了數萬的水稻樣品用于各種分子標記（SSR、InDel、SNP）和轉基因的基因型檢測。