| 實驗步驟 |
一、材料
1. 緩沖液和溶液
卡那霉素（10 mg/ml)
SDS 溶液（2%，m/V）
蔗糖凝膠加樣緩沖液
2. 凝膠
瓊脂糖凝膠（0.7%) 懸于 0.5 X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙錠
3. 培養基
加富的 M9 基本培養基平板
含 60 μg/ml 氨芐青霉素的 YT 瓊脂平板
2 X YT 培養基
含 60 μg/ml 氨芐青霉素的 2 X YT 培養基
含 25 μg/ml 卡那霉素的 2 X YT 培養基
4. 專用設備
水浴，調至 65℃
5. 載體和菌株
噬菌體 M13K07 ( 輔助）
大腸桿菌 F' 菌株
大腸桿菌 DH11S
大腸桿菌 DH11S，用 M13 噬菌體的噬菌粒載體轉化
大腸桿菌 DH11S，用帶有外源 DNA 的 M13 噬菌體的重組噬菌粒載體轉化
二、方法
高滴度輔助噬菌體原種的制備
成功使用噬菌粒的關鍵是制備已知精確滴度的輔助噬菌體原種。
1. 從加富的基本瓊脂平板上挑取一個大腸桿菌 DH11S 的新鮮單菌落，接種 20 ml 2 X YT 培養基，溫和揺動，37℃ 培養至 OD600 達 0.8。
2. 用 2 X YT 培養基制備一系列 10 倍稀釋的 M13K07 噬菌體，將稀釋的噬菌體鋪板，以獲得在 DH11S 細胞層中良好分離的噬菌斑。
3. 挑取分離良好的單個噬菌斑接種于裝有 2~3 ml 含 25 μg/ml 卡那霉素的 2 X YT 培養基的 15 ml 培養管中。溫和搖動（250 r/min), 37℃ 培養 12~16 h。
重要：以下步驟使用從單個新鮮挑取的噬菌斑獲得的 M13K07 原種。
4. 將感染上清轉移至 1.5 ml 無菌微量離心管，在微量離心機上，以最大轉速，4℃ 離心 2 min。上清轉移至新管中 4℃ 保存。
5. 采用在一株支持 M13 噬菌體生長的大腸桿菌 F' 菌株（TGI、DH11S、NM522 或 XLl-Bkie) 中形成噬菌斑的方法，測定每個噬菌體原種的滴度。
原種的感染噬菌體顆粒滴度應為 1010 pfu/ml。棄去所有低滴度的原種。
用輔助噬菌體增殖重組噬菌粒
6. 在兩塊含有 60 μg/ml 氨芐青霉素的 YT 瓊脂平板上，取重組噬菌粒轉化的和空噬菌粒轉化的 DH11S 菌劃線，37℃ 培養 16 h。
7. 挑取數個重組噬菌粒轉化克隆和 1~2 個其親本載體轉化的克隆，接種至裝有 2~3 ml 含 60 μg/ml 氨芐青霉素的 2 X YT 培養基的 15 ml 培養管中。
由于影響單鏈 DNA 得率的因素難以確定，應從每個噬菌粒重組體中挑取多個克隆，難以提高成功率。
8. 在每個培養管中加入 M13K07 輔助噬菌體至濃度為 2 X 107 pfu/ml。劇烈振蕩 ( 300 r/min) 37℃ 培養 1.0~1.5 h。
在這種短時間培養后，細菌培養液應只是略渾，如果生長過旺，用預熱的 2 X YT 培養基稀釋培養物，直至渾濁恰能看見。
9. 在培養物中加入卡那霉素至終濃度為 25 μg/ml，37℃ 14~18 h。
由于噬菌體 M13K07 含有一個卡那霉素抗性基因，因而在這一步加入抗生素后，只有那些被感染了的細菌才能存活。
其他輔助噬菌體（如 R408 ) 不帶抗生素抗性標記。在加入抗生素前應檢査輔助噬菌體的基因型。
10. 將菌懸液轉移至微量離心管，在微量離心機上，以最大轉速，室溫離心 5 min, 分離菌體和培養基，將上清轉移至新管中 4℃ 保存。
用凝膠電泳估計噬菌粒單鏈 DNA 的得率
11. 在 0.5 ml 微量離心管中分別加入 40 μl 上清與 2 μl 2% SDS, 輕拍管壁混合內容物，65℃ 溫育 5 min。
估計含噬菌粒單鏈拷貝的病毒顆粒的得率。先將上清稀釋后感染大腸桿菌
DH11S，然后鋪于含氨芐青霉素（60 μg/ml）的 YT 瓊脂平板。根據 37℃ 培養 24 h
后產生的氨芐青霉素抗性克隆數，計算上清中含噬菌粒單鏈 DNA 的病毒顆粒數，含 2 X 1011~ 5 X 1011 pfu/ml 的上清可以獲得滿意的純化噬菌粒單鏈 DNA 得率。
12. 在每個噬菌粒 DNA 樣品中加入 5 μl 加樣緩沖液，混合后加至 0.7% 瓊脂糖凝膠的加樣孔。
13. 6 V/cm 電泳數小時，至溴酚藍遷移至膠的大約一半。在紫外線下檢査和照相。
得率隨噬菌粒上外源 DNA 的大小和持性的不同而不同。但通常為約 1 μg/ml 培養物。
14. 從含大置單鏈 DNA 的上清中分離噬菌粒單鏈 DNA。按方案“M13 噬菌體單鏈 DNA 的制備”的步驟進行，將體積放大 2~3 倍。
噬菌粒和
M13 噬菌體載體一樣，隨外源 DNA 的大小和特性不同，其單鏈 DNA 的得率可以差五至十倍。 通常片段越大，得率越低。而且，即使外源
DNA 大小相同，其單鏈 DNA 的得率也可以有很大變化，如，大多數酵母 DNA 片段對噬菌粒的增殖，似乎沒有問題，然而同樣大小的人基因組
DNA 可能使單鏈 DNA 的得率令人失望。噬菌粒上外源 DNA 的插入方向和噬菌體 DNA
復制起點的方向也會對得率產生重要影響。因此，用相反方向重新克隆片段或換用噬菌體 DNA 復制起點方向相反的載體有時可以解決得率低的問題。
展開 |
