實驗方法原理 引物延伸法主要用于 mRNA5' 末端作圖。poly (A) + RNA 先與過量 5' 末端標記的且與靶 RNA 互補的單鏈寡核苷酸引物雜交，然后用反轉錄酶延伸這個引物。產生的 cDNA 與 RNA 模板互補且長度與引物 5' 末端和 RNA 5' 末端之間的距離相等。
實驗材料 多核苷酸激酶RNA 酶蛋白質抑制劑反轉錄酶寡核苷酸引物ATP
試劑、試劑盒 乙酸銨氯仿DTT乙醇甲酰胺加樣緩沖液KCl酚引物延伸反應混合物乙酸鈉TE三氯乙酸
儀器、耗材 變性聚丙烯酰胺凝膠水浴Whatman 3 MM 濾紙
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液與溶液
乙酸銨（10 mol/L）
氯仿
DTT ( 1 mol/L)
乙醇
甲酰胺加樣緩沖液（80% 去離子甲酰胺，10 mmol/L EDTA （pH 8.0），1 mg/ml 二甲苯腈藍，1 mg/ml 溴酚藍）
KCl ( 1.25 mol/L )
酚
引物延伸反應混合物（20 mmol/L Tris-Cl（pH 8.4）（室溫），10 mmol/L MgCl2，1.6 mmol/L dNTP 溶液，50 μg/ml 放線菌素 D）
乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2）
TE ( pH 7.6)
三氯乙酸（1% 和 10% TCA )
2. 酶與緩沖液
多核苷酸激酶
RNA 酶蛋白質抑制劑
反轉錄酶
3. 凝膠
含 8 mol/L 尿素的變性聚丙烯酰胺凝膠
4. 核酸和寡核苷酸
載體 RNA ( 酵母 tRNA)
放射性標記的用于凝膠電泳的 DNA 相對分子質量參照物
待分析的 RNA
寡核苷酸引物
5. 放射性化合物
[γ-32P] ATP（10 mCi/ml，7000 Ci/mmol）
6. 特殊裝備
42~95℃ ( 包括合適復性溫度）水浴
Whatman 3 MM 濾紙（或相當產品）
二、方法
寡核苷酸探針的制備
1. 如下反應體系中使寡核苷酸磷酸化
寡核苷酸引物（5~7 pmol 或 60 ng） 1 μl
去離子水 6.5 μl
10X 激酶緩沖液 1.5 μl
多核苷酸激酶（~10 個單位） 1 μl
[λ-32P] ATP（7000 Ci/mmol） 2 μl
37℃ 溫育 60 min。
2. 加入 500 ml TE ( pH 7.6) 終止反應。加入 25 μg 載體 RNA。
3. 加入 400 μl 平衡過的酚（pH 8.0) 和 400 μl 氯仿（或是 800 μl 的酚：氯仿 1:1 的混合物)。劇烈振蕩 20s。離心 2 min 分離水相和有機相。
4. 把水層移至新的無菌離心管，用 800 μl 氯仿抽提，劇烈振蕩 20 s。離心 2 min 分離水相和有機相。再把水層移至一新的無菌離心管中。
5. 重復步驟 4。
6. 向步驟 5 的水層加入 55 μl 無菌的 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2) 和 1 ml 乙醇。混勻并置于 -70℃ 至少 1 h。
7. 用最大轉速離心 15 min 收集寡核苷酸引物沉淀丟棄放射性的上淸。再用 70% 乙醇洗一次，棄上清，空氣中晾干沉淀。沉淀溶于 500 μl TE ( pH 7.6）。
8. 在液閃計數器的 10 ml 閃爍液中對 2 μl 放射性標記的寡核苷酸引物計數。假定 80% 回收率計算引物特異的放射活性。引物特異活性應為 2X106 cpm/pmol。
寡核苷酸引物的雜交和延伸
9. 混合 104~105 cpm ( 20~40 fmol）的 DNA 引物和 0.5~150 μg 的待分析 RNA。加入 0.1 倍體積的 3 mol/L 的乙酸鈉（pH 5.2) 和 2.5 倍體積的乙醇。置于 -70℃ 60 min。用最大轉速于 4℃ 離心 10 min 回收 RNA。用 70% 乙醇洗滌沉淀，再離心。小心移去乙醇，室溫放置直至最后痕量的乙醇揮發盡。
10. 每管用 8 μl TE ( pH 7.6) 重懸沉淀，反復抽吸幾次使之溶解。
11. 加入 2.2 μl 1.25 moI/L 的 KCl。輕輕混勻，離心 2s 使液體沉于管底。
12. 將寡核苷酸/RNA 混合物置于適當復性溫度的水浴中。在通過預實驗確定的最適溫度下溫育 15 min。
13. 在寡核苷酸和 RNA 復性時，按如下所述向引物延伸混合物中加入 DTT 和反轉錄酶：冰上溶解 300 μl 引物延伸混合物，然后加入 3 μl 1 mol/L 的 DTT 和終濃度為 1~2 單位/μl 的反轉錄酶。加入 0.1 單位/μl 的 RNA 酶的蛋白質抑制劑，倒轉幾次輕輕混勻，保存于冰上。
14. 從水浴中取出含有寡核苷酸引物和 RNA 的管，離心 2s 使液體沉于管底。
15. 每管加入 24 μl 引物延伸混合物。輕輕混勻，離心使液體沉于管底。
16. 42℃ 溫育 1 h 使引物延伸反應進行。
17. 加入 200 μl TE（pH 7.6），100 μl 平衡酚（pH 8.0），100 μl 氯仿終止反應。振蕩 20 s，室溫離心 4 min 分離水相和有機相。
18. 加入 50 μl 10 mol/L 的乙酸銨和 700 μl 乙醇沉淀核酸。振蕩充分混勻，-70℃ 放置至少 1 h。引物延伸產物的純化和分析。
19. 4℃ 離心 10 min 回收沉淀核酸，小心地用 400 μl 70% 乙醇洗滌。4℃ 離心 5 min，用吸頭移去 70% 乙醇洗滌液。室溫開口放置直至最后可見的乙醇揮發盡。
20. 用 10 μl 甲酸胺上樣緩沖液溶解核酸沉淀，反復抽吸幫助重溶。
21. 95℃ 加熱樣品 8 min，置于冰浴上。立即用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析引物延伸產物。
22. 當示蹤染料在凝膠中遷移了適當的距離后，關閉電源，打開電泳裝置的蓋。輕輕撬開較大玻璃板的一邊，慢慢從膠上移去玻璃板。切去凝膠的一角以定方向。
23. 假如所用的聚丙烯酰胺凝膠厚 1 mm，在 TCA 中固定。把含凝膠的玻璃板移至一個含過量的 10% TCA 的托盤中，室溫輕輕振動或轉動托盤 10 min。
24. 倒去 10% TCA，重新加入過量的 1% TCA，室溫輕輕振動或轉動托盤 5 min。
25. 倒去 1% TCA，用去離子水漂洗固定過的凝膠。從托盤中一起取出玻璃板和凝膠，置于平臺頂上用紙巾從邊緣吸去多余的水。
26. 剪一張各邊均比凝膠大 1 cm 的 Whatman 3 MM 濾紙（或相當產品）。把濾紙鋪在凝膠頂上再倒轉玻璃板使凝膠轉移到濾紙上。
27. 移去玻璃板，用熱真空凝膠干燥器于 60℃ 干燥 1.0~1.5 h。
28. 用放射自顯影或磷光成像得到凝膠的圖像。