用比濁法測定大腸桿菌的生長曲線

(一)實驗目的

了解細菌生長曲線的持點及測定原理，學會用比濁法測定細菌的生長曲線。

(二)實驗原理

將一定數量的細菌，接種于適宜的液體培養基中，在適溫下培養，定時取樣測數，以菌數的對數為縱坐標，生長時間為橫坐標，作出的曲線稱為生長曲線。該曲線表明細菌在一定的環境條件下群體生長與繁殖的規律。一般分為延緩期、對數期、穩定期及衰亡期四個時期，各時期的長短同菌種本身特征、培養基成分和培養條件不同而異。

比濁法是根據細菌懸液細胞數與混濁度成正比，與透光度成反比關系，利用光電比色計測定細胞懸液的光密度(即OD值)，用于表示該菌在本實驗條件下的相對生長量。

實驗設正常生長、加酸抑制和加富培養等三種處理，以了解細菌在不同生長條件下的生長情況。

（三）實驗器材

(1)活材料：大腸桿菌(E.coli)。

(2)培養基和試劑：牛肉膏蛋白胨液體培養基14支(每支10mL)，濃縮5 倍的牛肉膏蛋白胨培養基1支。無菌酸溶液(甲酸：乙酸：乳酸=3：1：1)。

(3)器材：1mL無菌吸管、搖床、冰箱、光電比色計、標簽等。

（四）實驗方法

方法(1)

1)接種：取13支裝有牛肉膏蛋白胨培養液的試管，貼上標簽(注明菌名、培養處理、培養時間、組號)。按無菌操作法用吸管向每管準確加入0.2mL 的大腸桿菌培養液，接種后，輕輕搖蕩，使菌體混勻。另一支不接種的培養管注明CK(對照)。

2)培養：將接種后的培養管置于搖床上，在37℃下振蕩培養。其中9支培養管分別于培養的0、1．5、3、4、6、8、10、12和14h后取山，放冰箱中貯存，待測定。加酸處理。取出經4h培養的另二支培養管，按無菌操作法加入lmL無菌酸溶液，搖勻后放回搖床上，繼續振蕩培養，于培養8h和 14h后取出放冰箱中貯存，待測定。加富營養物處理。余下的二支培養管于培養6h后取出，按無菌操作法加入濃縮5倍的牛肉膏蛋白胨培養液1mL，搖勻后，繼續進行振蕩培養，于培養8h和14h后取出，放入冰箱中貯存，待測定。

3)比濁：將培養不同時間、形成不同細胞濃度的細菌培養液進行適當稀釋，使光密度值在0.0-0.4范圍內，以未接種的牛肉膏蛋白胨液體培養基調零點，在光電比色計上，選用400-440nm波長的濾光片進行比濁，從最稀濃度的菌懸液開始，依次測定。

方法(2)

將大腸桿菌接入裝有牛肉膏蛋白胨培養液的小試管中(試管要能插入放比色杯的比色槽內)。37℃下振蕩培養，分別在0、1.5 、3、4、6、8、10、12和14h取出，以未接種培養液調零點，在光電比色計上比色。比色時應自制一個暗盒將培養管和比色槽罩住，以形成一個暗室。

（五）繪制曲線

以細菌懸液的光密度值(OD)為縱坐標，培養時間為橫坐標，給出大腸桿菌在正常生長、加酸處理和加富培養三種條件下的生長曲線。

如果我們將上述培養0，1.5，3，4，6，8，10，12，14h的細菌懸液用稀釋平板測數法進行測數，測出不同時間的含菌數，以菌懸液比濁的光密度值為橫坐標，以細菌的數量為縱坐標，繪制一標準曲線，這樣在測得了任一培養時間的菌懸液光密度值后，就可以在此標淮曲線上查出含菌數。這種方法已在工業上廣泛采用，它可以節省許多稀釋平板測數的時間， 直接用比濁法測得的光密度值查標準曲線以了解各個培養時期的菌數消長情況。