實驗概要
識別/分離骨髓祖細胞技術和定量RT-PCR技術的結合將是理解造血分子機制基礎的一個功能強大的工具。本實驗，我們描述了用于熒光激活細胞分類（FACS）技術的的小鼠骨髓祖細胞標準染色程序。
主要試劑
1. 1×的PBS/2％胎牛血清(FCS，無菌)
2. ACK緩沖液(41.45克NH4Cl，5克KHCO3，0.18克EDTA溶解于5升H2O中，儲存在4°C，過濾，消毒)
3. 碘化丙啶(PI，Sigma公司)，制成500×的儲備液(1.0mg/mL時)保存于通風柜中
4. 抗體(本文所提供的抗體用量僅僅是一個例子。每次使用一個新的批處理時，即使是相同目錄編號的抗體也需要重新測定用量)
5. 三色(TC=藻紅蛋白，PE-Cy5標記)標記的鼠抗CD3，CD4，CD8，CD19，B220和GR-1(Caltag公司)
6. 別藻藍蛋白(APC)標記的抗C-KIT(BD Pharmingen公司)
7. FITC標記的抗CD34(BD Pharmingen公司)
8. 生物素化的抗SCA-1(BD Pharmingen公司)
9. PE標記的抗FcγRIII/II(eBioscience)
10. 鏈霉親和素-APC-Cy7(Caltag公司)
11. FITC，PE，APC(BD Pharmingen公司)
12. TC和APC- cy7(Caltag)標記的抗B220抗體
主要設備
1. 5毫升帶帽聚丙烯管(12×75毫米)
2. 聚丙烯50毫升錐形管
3. 磁珠(羊抗鼠IgG)和磁鐵架(DYNAL生物)
4. 尼龍網(40-70微米孔徑)
實驗步驟
1. 收集細胞
1) 收獲骨髓細胞(骨髓)和脾細胞，在1×PBS/2％FCS在50 ml錐形管中重懸浮；
2) 1300rpm減速離心5分鐘；
3) 棄去液體；
4) 加入500μL 的ACK緩沖液，冰浴或室溫下用吸管小心吹打1-5分鐘(直到液體清亮)；
5) 加入40毫升1×PBS2％FCS，混勻；
6) 1300rpm減速離心5分鐘；
7) 懸浮細胞如下(建議在染色前后使用尼龍網過濾單細胞懸液，以避免堵塞流式細胞儀)：
每個小鼠的骨髓細胞，在5毫升管中懸浮于100μL 1×PBS / 2％FCS中(依鼠的數量相應增加)。每個小鼠的脾細胞懸浮于350μL 1×PBS / 2％FCS。
2. 骨髓細胞染色
1) 加入3μL抗CD3-TC抗體，2μl抗CD4 –TC抗體，2μl抗CD8a-TC抗體，2μl抗CD19 –TC抗體，3μl抗Ly-6G (Gr-1)-TC抗體，3μl抗CD45R (B220)-TC抗體；
2) 冰浴黑暗條件下混合孵育30分鐘；
3) 用3ml的1×PBS/2%FCS洗兩次；
4) 如有實驗有必要進行譜系消減，可進行如下操作，如無必要則略過4、5兩步，直接進行第6步操作：
a. 骨髓細胞重懸于100μl的1×PBS/2％FCS，添加磁珠70μL；
b. 管在4℃，黑暗條件下旋轉30分鐘；
c. 加入4.5毫升1×PBS / 2％FCS，混勻；
d. 將管置于磁架上，室溫下處理2分鐘；
e. 用巴斯德管將液體移到新的管中(如需過夜，把液體置于15-20毫升1×PBS / 2％FCS，4°C黑暗保存)；
f. 1300rpm減速離心5分鐘。
5) 于100μl的1×PBS / 2％FCS中重懸骨髓細胞；
6) 加入5μl抗CD34-FITC抗體，3μl抗FcγRIII/II-PE抗體，2μl抗CD117 (c-kit)-APC抗體和2μl抗Sca-1 (Ly-6A/E)-biotin抗體；
7) 混合并在黑暗條件下冰浴孵育30分鐘；
8) 用3ml的1×PBS/2%FCS洗兩次；
9) 于100μl的1×PBS / 2％FCS中重懸；
10) 添加2μL鏈霉親和素-APC-Cy7；
11) 混合并在黑暗條件下冰浴孵育30分鐘；
12) 用3ml的1xPBS/2%FCS洗兩次并重懸細胞，其密度在 5×107/ml為最佳；
13) 加入碘化丙啶染色死細胞(終濃度為2μg/ml)；
14) 黑暗冰浴保存直至用于實驗。
3. 脾細胞染色(我們使用單色流式細胞儀補償控制)
1) 等分脾細胞至7支試管(每管50μL)，分別標示為＃1-＃7；
2) 每管分別加入以下的抗體：#1不加； #2加入PI(終濃度2μg/ml)；#3加入1μl抗B220-FITC抗體；#4加入1μl抗B220-PE抗體；#5加入1μl抗B220-APC抗體；#6加入1μl抗B220-APC-Cy7抗體；#7加入1μl抗B220-TC抗體；
3) 混合并在黑暗條件下冰浴孵育30分鐘；
4) 用3ml的1xPBS/2%FCS洗兩次；
5) 于500μl的1×PBS / 2％FCS中重懸(除#2外都不加PI)。