第二種方法，也稱為"nested peptide secquendng", 是在一個 Edman 降解循環中多次加入多肽/蛋白質底物心在此法中加入過量易揮發的 Edman 試劑以使反應完全，每一循環中的過顯試劑可通過蒸發被除去。經 MALDI-MS 分析得到肽序列階梯，實現階梯測序。這兩種方法都需要底物蛋白質為自由 N 末端，并且不能分辨同質異核氨基載殘基亮氨酸和異亮氨酸 谷氨酰胺（殘基質量 128. 13) 和賴氨酸（殘基質量 128. 17), 在CID 譜中很難分辨，但在這兩種方法中可輕易分辨 。CID為賴氨酸側鏈的氨基會被反應試劑修飾。理論上講，這兩種方法都能分析肽混合物，只要肽段之間質量差異明顯，不會與降解產物質量重疊。除（逐步化學降解法，氨肽酶和羧肽酶也可以截短肽段產生肽階梯序列。此方法的好處是可以將很少量的起始反應物直接放在MALDI 樣品靶的表面反應， 只要加入基質就可以終止反應。通過控制反應時間可以改出較長的序列，此方法不能分辯 Gln 和Lys 及 Ile 和 Leu 。如果 CID 能產生高質量的譜，例如譜圖含有完整的，和 b 系列離子，那么，通過對碎片離子的從頭解析可以確定肽段的序列。但是，通營對 y 和 b 離子的判斷具有很低的置信度，使得讀出的終序列很困難。使 CID 譜圖解析變得復雜的主要因素包括：①碎片離子只失，如產生不完整的離子系列；②將觀察到的信號歸展為某一特定離子系列較困難。通過在酶切過程中對 C未端離子的特異性同位素標記，可以使 y 系列離子的鑒別變得較為容易。
這一方法利用了胰蛋白酶的水解特性，即在 C 末端新生成的羧基中從水分子中結合一個氧。因此，如果在胰蛋自酶水解緩沖液中含有 H218O. 那么所含的肽段（除了(末端肽段）都會有一個同位素標記的 C 末端羧基團 。通過在含 50% H218O /H216O的緩沖液中進行胰蛋白酶酶切反應，所有的新生肽段（除了 C 末端肽段）都將表現為一對峰，兩峰質量數相差 2個質量單位，同時他們的離子強所也只有在 H2160 溶液中正常水解產生肽段離子強度的一半 。胰蛋白酶切點在賴氨酸和精氨酸之后的肽鍵，通過激活胰蛋白酶 195 位絲氨般的 OH 基團，與賴氨酸或精氨算的羧基形成共價結合的速同時釋放新形成的 N 末端。活性水分子攻擊過渡態使酯鍵斷裂，釋放新生肽段，肽段的羧基上含有一個從溶劑水中獲取的氧，溶劑水為H218O /H216O的機率相當。這樣，當這兩種離子都被質譜儀選擇為母離子時，只有具完整 C 末端的離子系列(y 系列離千及其中性丟失離子）會以相差 2u 的雙峰存在。這樣就區別出 (y 系列離子并可計算出序列差異令對肽段進行從頭測量，雖然這種方法簡化（對特定離子系列的確認，但也減小（每一個 y 離子的信號強理，圍此使高靈敏度的測序更為困難。使用高分辨的質譜儀如四極桿-飛行時間串聯質譜儀可以實現在單次實驗中對肽段譜圖的完全解析, 同時這種方法已成功應用于離子阱質譜儀。 展開 | 