本方案以 poly(A) + RNA 作為模板，通過隨機引物反應合成 cDNA 探針，這類探針可用于 cDNA 文庫的差異篩選。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 本方案以 poly(A) + RNA 作為模板，通過隨機引物反應合成 cDNA 探針，這類探針可用于 cDNA 文庫的差異篩選。 |
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| 實驗材料 | 反轉錄酶反轉錄酶緩沖液隨機脫氧核苷酸引物模板 mRNA |
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| 試劑、試劑盒 | 乙酸銨DTTEDTA乙醇HClNaOH酚氯仿胰 RNA 酶抑制劑SDSTris-CldNTP 溶液 |
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| 儀器、耗材 | 冰水浴Sephadex G-50 離心柱水浴或加熱板 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液與溶液
乙酸銨（10 mol/L）
DTT (1 mol/L)
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
HCl ( 2.5 mol/L)
NaOH ( 3 mol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V）
胰 RNA 酶抑制劑（20 單位/μl )
SDS ( 10% m/V)
Tris-Cl ( 1 mol/L，pH 7.4)
2. 酶和緩沖液
反轉錄酶
10X 反轉錄酶緩沖液
3. 核酸與寡核苷酸
含有 dATP、dGTP 和 dTTP 各 20 mmol/L 的 dNTP 溶液
dCTP ( 125 μmol/L)
長度為六或七個堿基的隨機脫氧核苷酸引物
模板 mRNA
4. 放射性化合物
[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性為 >3000 Ci/mmol)
5. 專用設備
冰水浴
Sephadex G-50 離心柱，平衡于 TE（pH 7.6）
預熱至 45℃、68℃ 和 70℃ 的水浴或加熱板
二、方法
1. 將 1 μg poly(A)+RNA 轉移至消毒的微量離心管。用無 RNA 酶的水將溶液的體積調至 4 μl。蓋緊微量離心管蓋，于 70℃ 加熱 5 min，然后迅速將離心管轉至冰水浴中。
2. 在微量離心管的冷溶液中加入：
10 mmol/L DTT 2.5 μl
胎盤 RNA 酶抑制劑 20 單位
隨機脫氧寡核苷酸引物 5 μl
10X 反轉錄緩沖液 2.5 μl
20 mmol/L dGTP、dATP 和 dTTP 溶液 1 μl
125 μmol/L dCTP 溶液 1 μl
10 mCi/ml [α-32P] dCTP
( 比活性為 > 3000 Ci/mmol) 10 μl
無 RNA 酶的水 加至 24 μl
反轉錄酶（200 單位） 1 μl
3. 加入下列試劑以終止反應：
0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 1 μl
10% （m/V）SDS 1 μl
充分混合管中的試劑。
4. 在反應管中加入 3 μl 3 mol/L NaOH，68℃ 溫育混合物 30 min 以水解 RNA。
5. 使反應混合物的溫度冷卻至室溫，加入 10 μl 1 mol/L Tris-Cl（pH 7.4）以中和溶液，混勻，然后加入 3 μl 2.5 mol/L HCl。取極小量液體滴在 pH 試紙上，以檢測溶液的 pH。
6. 用酚：氯仿抽提純化 cDNA。
7. 用離心柱層析或在 2.5 moI/L 醋酸銨存在下用乙醇選擇性地沉淀放射性標記的探針以與未摻入的 dNTP 分離。
8. 用三氯乙酸（TCA）沉淀法或 DE-81 濾膜結合法來確定放射性標記 dNTP 摻入的比例。 |
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