試劑、試劑盒 ddH20Vent 緩沖液Vent DNA 聚合酶 dNTP質粒 DNAPCR 引物
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備熱循環儀
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
ddH20
2. 酶和酶緩沖液
10X Vent 緩沖液
Vent DNA 聚合酶
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP，各 20 mmol/L
PCR 引物，可以與基因組 DNA 文庫克隆位點兩側的載體序列退火
質粒 DNA(見下面第 1 步）
4. 特殊設備
瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備，包括溴化乙錠 (見第 5 步）
熱循環儀
二、方法
1. 在細菌中擴增后，用基因組文庫制備的質粒 DNA 建立下列反應。
10~50ng 的質粒 DNA
50pmol 的各引物
5ul 的 10XVent 緩沖液
dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul
1U 的 Vent DNA 聚合酶
用 ddH20 定容至 50ul
對下面的每種質粒載體應該分別進行反應：
表達載體，沒有文庫 DNA 插入
基因組 DNA 文庫的混合物
少量 DNA, 由基因組 DNA 文庫的單個細菌克隆制備
2. 在一個熱循環儀中，94°C 將混合物預熱 20s。
3. 按下面的參數進行 30 輪 PCR 循環。
94°C15s
55°C10s(或用引物的合適退火溫度）
72°C40s
將最后一次循環的延伸時間延長至 60s。
4. 冷卻至 4C。
5. 取 25ul 的各反應產物，跑 4% 的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠染色分析（Sambrook and Russell 2001)
三、分析
在圖 26-6 所示的例子中，對文庫混合物進行 PCR 分析，其中用的引物是 PmlⅠ位點的側翼序列，結果顯示，文庫中含有目的大小的插入片段，但有大量的原始載體的污染 [圖 26-6(a), 第 2 泳道]。從文庫中選擇單個克隆進行 PCR 分析，驗證了用文庫混合物做模板的結果，顯示文庫中的原始載體大約占 40%[所分析的 24 個克隆中有 10 個，圖 26-6(a), 第 3~26 泳道]。為了提高文庫的質量，用 PmlⅠ酶消化文庫，然后在細菌中重新進行擴增，以減少原始載體的污染。對文庫混合物進行 PCR 分析顯示，用 PmlⅠ消化后，無插入的環狀載體的污染大大減少了 [圖 26-6(b), 第 2 泳道和第 3 泳道]。用 PmlⅠ消化又重新在細菌中擴增后，在文庫中隨機選擇單個克隆進行 PCR 分析，證實無插入 DNA 的出現頻率比原始文庫大大降低 [20 個克隆中有 0 個，小于 5%，圖 26-6(b), 第 4~23 泳道]，并且克隆中含有預計大小的插入片段。對基因組片段文庫中的克隆進行 DNA 序列分析顯示，文庫中含有預計大小的人類基因組 DNA 片段（數據沒有列出）。因此，PCR 提供了一個快速、敏感和方便的方法，來分析原始的和改善過的文庫。
