用T4RNA連接酶連接RNA分子

實驗材料 T4RNA連接酶供體RNA受體RNA

試劑、試劑盒 10XT4RNA連接酶緩沖液無核酸酶的水FEGRNA酶抑制劑

實驗步驟

一材料與設備

1)10XT4RNA 連接酶緩沖液：50 mmol/LTris (pH7,8)，l0 mmol/L MgCl2，5 mmol/LDTT,1 mmol/L ATP

2) 無核酸酶的水

3)FEG(polyethyleneglycol)40%

4)RNA 酶抑制劑

5)T4RNA 連接酶

6) 供體（donor)RNA

7) 受體（acceptor)RNA

(二）操作方法

1) 進行 RNA 與 RNA 分子連接的反應體系如下：

供體 (donor)RNA                                              100-500ng

受體 (acceptor)RNA                                            250ng

10XT4RNA 連接酶緩沖液                                     4ul

RNasin 核酸酶抑制劑 (40U/ul)                             1ul

PEG,40%                                                             20ul

T4RNA 連接酶 (9-12U/u1)                                   1ul

補無核酸酶的水至終體積為                                 4u1

2)37℃ 孵育 30 min，或 16℃ 反應過夜.

3) 純化回收，一 20℃ 保存。

注意事項

1) 供體（donor)RNA 分子如Poly(A)+RNA) 必須包含 5＇磷酸基團。

2)RNA 分子能有效的被多聚核苷酸激酶磷酸化。