甲基化干擾法鑒定與蛋白結合的DNA位點

放射性標記DNA探針的制備

l      聚丙烯酰胺凝膠的制備

1．按照（三）中操作流程灌制非變性聚丙烯酰胺凝膠。將10×TBE稀釋成0.5×的工作濃度。聚丙烯酰胺的工作濃度取決于待測DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝膠，小于100bp的片段應灌制6～8％的凝膠。

l      DNA的標記

1．用兩種限制性內切酶從10μg質粒上將待測DNA片段切下。注意務必使至少一種酶酶切后產生5’凸出末端。酶切體系終體積50μl，在適宜的酶反應緩沖液條件下反應1小時。

2．向酶切反應混合液中加入

[α－³²P]dATP（約10μCi/μl）(若5’凸末端含T殘基)            10μl

dCTP(2mmol/L)                                               1μl

dGTP(2mmol/L)                                               1μl

dTTP(2mmol/L)                                               1μl

DNA聚合酶（Klenow片段）（5單位/μl）                       1μl

室溫溫育反應體系30分鐘。

3．加入7μl 10×上樣緩沖液終止反應。

l      標記探針的分離

1．將反應混合物上樣于非變性凝膠。

2．10～15V/cm條件下，用0.5×TBE緩沖液電泳2～3小時。

3．將玻璃板從電泳槽中取出，分開，并使凝膠粘附于其中任一塊板上。用保鮮膜將凝膠覆蓋起來。

4．將凝膠室溫下對X光片曝光1分鐘。小心操作使得顯像后的X光片與凝膠能以曝光時方位復原。

5．用保鮮膜覆蓋在放射性自顯影照片上。再將帶凝膠的玻璃板放在其上，以照片為模板，用刀片切下含標記DNA片段的凝膠片。將該凝膠片切成小片（約1mm²）后，放入微量離心管中。

6．向管中加入1ml洗脫緩沖液，37℃連續振蕩，溫育過夜。

7．將洗脫液轉入兩個干凈微量離心管中（每管500μl），然后各加入1ml 100％乙醇，－80℃放置10分鐘。室溫離心15分鐘沉淀DNA。

8．棄上清，用80％乙醇洗沉淀，室溫離心5分鐘，用長頸巴斯德吸管移去上清，再用真空離心蒸發濃縮器或干燥器干燥沉淀。

9．用閃爍計數器測定樣品中的契侖科夫輻射量。將沉淀溶于適量TE中使標記探針的濃度為約10⁴cpm/μl。

甲基化反應

1．室溫下，于微量離心管中建立如下列反應（每一DNA片段需6個離心管，3個用于起始反應，3個用于終止反應）

2．在1號和2號管中加1μl DMS，并加3μl 10％甲酸于3號管中起始反應。

3．將1號和2號管在16℃下放足4分鐘，3號管在37℃溫育15分鐘。加入適量終止液終止反應。

4．劇烈振蕩離心管并置于干冰/乙醇浴6分鐘。

5．4℃離心7分鐘。

6．用長巴斯德吸管棄上清，用1ml 100％乙醇清洗沉淀。

7．室溫下離心3分鐘。

8．棄去上清。

9．用干燥器或真空離心蒸發濃縮器干燥沉淀，2號管的DNA沉淀用于結合反應，1號及3號管保存于－20℃備用。