(R)-甲氨蝶呤
照高效液相色譜法（通則0512）測定。
供試品溶液：取本品，加流動相溶解并稀釋制成每1mL中約含0.2mg的溶液。
對照溶液：精密量取供試品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。
系統適用性溶液：取消旋甲氨蝶呤，加流動相溶解并稀釋制成每1mL中約含40μg的溶液。
色譜條件：用牛血清白蛋白鍵合硅膠為填充劑，以正丙醇-磷酸鹽緩沖液（pH6.9）（取0.71%無水磷酸氫二鈉溶液500mL，加0.69%磷酸二氫鈉溶液600mL，搖勻，用2mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.9）（8: 92）為流動相，檢測波長為302nm，進樣體積20μL。
系統適用性要求：系統適用性溶液色譜圖中，出峰順序依次為(S)-甲氨蝶呤峰與(R)-甲氨蝶呤峰，其分離度應大于3.0。
測定法：精密琵取供試品溶液與對照溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
限度：供試品溶液色譜圖中如有(R)-甲氨蝶呤峰，其峰面積不得大于對照溶液主峰面積的3倍（3.0%）。
有關物質
照高效液相色譜法（通則0512）測定。
供試品溶液：取本品，加流動相溶解并稀釋制成每1mL中含1mg的溶液。
對照溶液：精密屈取供試品溶液1mL，置200mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。
系統適用性溶液：分別取甲氨蝶呤與葉酸，用流動相溶解并稀釋制成每1mL中各約含0.1mg的混合溶液。
色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-7.0%枸櫞酸溶液-2.0％無水磷酸氫二鈉溶液（8.5:10:80）（用7.0％枸櫞酸溶液或2.0%無水磷酸氫二鈉溶液調節pH值至6.0）為流動相，檢測波長為302nm，系統適用性溶液進樣體積10μL，其他溶液進樣體積50μL。
系統適用性要求：系統適用性溶液色譜圖中，理論板數按甲氨蝶呤峰計算不低于1000，甲氨蝶呤峰與葉酸峰之間的分離度應大于8.0。
測定法：精密量取供試品溶液與對照溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4倍。
限度：供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，單個雜質的峰面積不得大于對照溶液的主峰面積（0.5%），各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的4倍（2.0%）。
水分
取本品，照水分測定法（通則0832第一法1）測定，含水分不得過12.0%。
熾灼殘渣
取本品1.0g，依法檢查（通則0841），遺留殘渣不得過0.1%。
重金屬
取本品0.50g，加25%硫酸鎂的硫酸溶液（取硫酸鎂25g，加1mol/L硫酸溶液100mL使溶解）4mL，搖勻，置水浴上蒸發至干，于800°C緩緩熾灼至完全炭化，熾灼時間不超過2小時，放冷，依法檢查（通則0821第二法），含重金屬不得過百萬分之五十。