電子顯微鏡使用實驗（一）

實驗方法原理

一、電子顯微鏡的分辨力和放大率

電子顯微鏡是利用電子流代替光學顯微鏡的光束使物體放大成像而由此得名的。發射電子流的電子源部分稱為電子槍，電子槍由發射電子的“V”形鎢絲及陽極板組成，在高真空中，鎢絲被加熱到白熾程度，其尖端便發射出電子，發射出來的電子受到陽極很高的正電壓的吸引，使電子得到很大的加速度而到達樣品。電壓越高，電子流速度越快，波長越短，其分辨能力也越強。一般用50-100 kV電壓時，電子波長在0.54-0.37 nm，所以電子顯微鏡的分辨力極高，可達0.2 nm左右，此分辨力比光學顯微鏡提高了近1 000倍。

在電子流的通路上不能有游離的氣體分子存在，否則由于氣體分子與電子的碰撞而造成電子的偏轉，導致物像散亂不清。因此，電子顯微鏡除需要高電壓外，還需要高真空的裝置。

電子顯微鏡的放大率是由透鏡決定的，在電子顯微鏡中，透鏡是由看不見的電磁場構成的，稱為電磁透鏡，簡稱磁透鏡。由電子槍發射出的電子流可以通過磁透鏡的磁場吸引發生偏折而放大物體，這與光學顯微鏡的光線通過玻璃透鏡發生折射而放大物體的情況一樣，但它不同于光學顯微鏡的是可利用多個磁透鏡的組合而得到逐級放大的電子像，所以現代電子顯微鏡的成像系統由多個電磁透鏡組成。而光學顯微鏡由于玻璃透鏡本身存在有相差的缺陷，其放大率不能通過增加透鏡的數目來無止境地提高。

此外，通過改變這些電磁透鏡的磁場強度也可提高放大率。磁場越強，焦距越短，放大倍數也就越大。所以現代電子顯微鏡的成像物鏡大多數采用短焦距的強磁透鏡，放大倍數可達一百萬倍以上。

二、電子顯微鏡的成像原理

任何一個物體都是由原子組成的，原子則是由原子核與軌道電子組成的。當電子束照射到樣品上的時候，一部分電子能從原子與原子之間的空隙中穿透過去，其余的電子有一部分會與原子核或原子的軌道電子發生碰撞被散射開來；一部分電子從樣品表面被反射出來；還有一些電子是被樣品吸收以后，樣品激化而又從樣品本身反射出來等。如果把所有這些不同類型的電子收集起來，使它們成像，便可以構成不同類型的電子顯微鏡。這里只著重介紹透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。

1.  透射電子顯微鏡

透射電子顯微鏡收集的是透過樣品的電子。在透射電子顯微鏡中，物像的形成主要來自電子的散射作用與干涉作用。散射作用分“彈性散射”和“非彈性散射”兩種。彈性散射指電子和原子核發生碰撞，電子基本上不損失能量，而只是改變運動方向，這種碰撞稱為彈性碰撞，這時候我們說電子發生了“彈性散射”作用。如果電子是和軌道電子發生碰撞，電子不僅會改變原來運動的方向，而且還會損失一部分能量，這時電子便發生了“非彈性散射”作用。

由于物體上不同部位的結構不同，它們散射電子的能力也各不相同，結果使透過樣品的電子束發生疏密的差別，在散射電子能力強的地方，透過去的電子數目少，因而打在熒光屏上所發出的光就弱，顯現為暗區；而散射電子能力弱的地方，透過的電子數目多，打在熒光屏上所發出的光就強，顯現為亮區，這樣，便在終像上造成了有亮有暗的區域，因而出現了反差，人眼就可以辨別。散射作用形成的反差造成強度上的變化，因此又稱為“振幅反差”。由于在電子顯微鏡中利用的是人眼看不見的電子流，所以通常用一塊熒光屏來把電子流轉換成可見的熒光，使人眼可以接受。

除了散射作用能引起反差外，電子的干涉作用也能造成反差，在電子發生非彈性碰撞的時候，由于電子會失去一部分能量，因而使它前進的速度變慢，這部分速度減慢的電子會和速度不變的電子發生干涉作用，結果造成電子相位上的變化，從而也引起反差，稱為“相位反差”。

在低倍觀察時，振幅反差是主要的反差來源，而在高倍觀察時，也就是在辨別極小的（如1 nm大小）細微結構時，相位反差則起主要作用。

2.  掃描電子顯微鏡

與透射電子顯微鏡不同，掃描電子顯微鏡是把從樣品表面反射出來的電子收集起來并使它們成像，所以又稱反射電子顯微鏡。掃描電子顯微鏡的成像原理與電視或電傳真照片的原理相似，由電子槍產生的電子束經過三個磁透鏡的作用，形成一個很細的電子束，稱為電子探針。電子探針經過透鏡聚焦到樣品表面上，按著順序逐行逐行地通過樣品，也就是對樣品掃描，然后把從樣品表面發射出來的各種電子（二次電子、反射電子等）用探測器收集起來，并轉變為電流信號經放大后再送到顯像管轉變成圖像。

掃描電子顯微鏡主要用來觀察樣品的表面結構，分辨力可達10 nm，放大范圍很廣，可從20倍到幾十萬倍。透射電子顯微鏡的分辨力雖然很高，但是一般只能觀察切成薄片后的二維圖像，掃描電子顯微鏡能夠直接觀察樣品表面的立體結構，并且具有明顯的真實感。許多電子無法透過的較厚樣品，只能用掃描電子顯微鏡才能看到。

實驗材料 大腸桿菌

試劑、試劑盒 濃硫酸醋酸戊脂醋酸戊脂濃硫脧NaOH乙醉無菌水磷鎢酸鈉 聚乙烯甲醛三氯甲烷細胞色素c醋酸銨質粒pBR322

儀器、耗材 普通光學顯微鏡鑷子銅網瓷漏斗燒杯平皿滴管大頭針載玻片細菌計數板真空鍍膜機臨界點干燥儀

實驗步驟

一、金屬網的處理

光學顯微鏡的樣品是放置在載玻片上進行觀察，而在透射電鏡中，由于電子不能穿透玻璃， 只能采用網狀材料作為載物，通常稱為載網，載網因材料及形狀的不同可分為多種不同的規格， 其中最常用的是200?400目（孔數）的銅網，網在使用前要處理，除去其上的污物，否則會影響支持膜的質量及標本照片的清晰度，本實驗選用的是400目的銅網，可用如下方法進行處理：首先用醋酸戊酯浸漂幾小時，再用蒸餾水沖洗數次，然后再將銅網浸漂在無水乙醇中進行脫水，如果銅網經以上方法處理仍不干凈時，可用稀釋的濃硫酸（1:1）浸1-2 min，或在1%NaOH溶液中煮沸數分鐘，用蒸餾水沖洗數次后，放人無水乙醇中脫水，待用。

二、支持膜的制備

在進行樣品觀察時，在載網上還應覆蓋一層無結構、均勻的薄膜，否則細小的樣品會從載網的孔中漏出去，這層薄膜通常稱為支持膜或載膜，支持膜應對電子透明，其厚度一般應低于20 mm在電子束的沖擊下，該膜還應有一定的機械強度，能保持結構的穩定，并擁有良好的導熱性；此外，支持網在電鏡下應無可見的結構，且不與承載的樣品發生化學反應，不干擾對樣品的觀 察，其厚度一般為15 nm左右，支持膜可用塑料膜（如火棉膠膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金屬膜（如鈹膜等）。常規工作條件下，用塑料膜就可以達到要求，而塑料膜中火棉膠膜的制備相對容易，但強度不如聚乙烯甲醛膜。

1.  火棉膠膜的制備

在一干凈容器（燒杯、平皿或下帶止水夾的瓷漏斗）中放入一定置的 無菌水，用無菌滴管吸2%火棉膠醋酸戊酯溶液，滴一滴于水面中央，勿振動，待醋酸戊酯蒸發，火膜膠則由于水的張力隨即在水面上形成一層薄膜，用鑷子將它除掉，再重復一次此操作，主要是為了清除水面上的雜質，然后適量滴一滴火棉膠液于水面，火棉膠液滴加量的多少與形成膜的厚薄有關，待膜形成后，檢查膜是否有皺折。如有，則除去一直待膜制好。

所用溶液中不能有水分及雜質，否則形成的膜的質量較差，待膜成型后，可從側面對光檢查所形成的膜是否平整及是否有雜質。

2.  聚乙烯甲醛膜（formvar膜）的制備

（1）洗干凈的玻璃板插人0.3% formvar溶液中靜置片刻，時間視所要求的膜的厚度而定，然后取出稍稍晾干便會在玻璃板上形成一層薄膜；

（2）用鋒利的刀片或針頭將膜刻一矩形；

（3）將玻板輕輕斜插進盛滿無菌水的容器中，借助水的表面張力作用使膜與玻片分離并漂浮在水面上。

所使用的玻片一定要干凈，否則膜難以從上面脫落；漂浮膜時，動作要輕，手不能發抖，否則膜將發皺；同時， 操作時應注意防風避塵，環境要干燥，所用溶劑也必需有足夠的純度，否則都將對膜的質量產生不良影響。

三、 轉移支持膜到載網上

轉移支持膜到載網上，可有多種方法，常用的有如下二種：

1.  將洗凈的網放人瓷漏斗中，漏斗下套上乳膠管，用止水夾控制水流，緩緩向漏斗內加人無菌水，其量約髙1 cm；用無菌鑷子尖輕輕排除銅網上的氣泡，并將其均勻地擺在漏斗中心區域；按2所述方法在水面上制備支持膜，然后松開水夾，使膜緩緩下沉，緊緊貼在銅網上；將一清潔的濾紙覆蓋在漏斗上防塵，自然干燥或紅外線燈下烤干。干燥后的膜，用大頭針尖在銅網周圍劃一下，用無菌攝子小心將銅網膜移到載玻片上，置光學顯微鏡下用低倍鏡挑選完整無缺、厚薄均勻的銅網膜備用。

2.  按2所述方法在平皿或燒杯里制備支持膜，成膜后將幾片銅網放在膜上，再在上面放一張濾紙，浸透后用鑷子將濾紙反轉提出水面。將有膜及銅網的一面朝上放在干凈平皿中，置40℃烘箱使干燥。

四、制片

透射電鏡樣品的制備方法很多，如超薄切片法、復型法、冰凍蝕刻法、滴液法等，其中滴液法，或在滴液法基礎上發展出來的其他類似方法如直接貼印法、噴霧法等主要被用于觀察病毒粒子、細菌的形態及生物大分子等。而由于生物樣品主要由碳、氫、氧、氮等元素組成，散射電子的能力很低，在電鏡下反差小，所以在進行電鏡的生物樣品制備時通常還須采用重金屬鹽染色或金屬噴鍍等方法來増加樣品的反差，提高觀察效果。例如負染色法就是用電子密度高，本身不顯示結構且與樣品幾乎不反應的物質（如磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀）來對樣品進行染色。由于這些重金屬鹽不被樣品成分所吸附而是沉積到樣品四周，如果樣品具有表面結構，這種物質還能穿透進表面上凹陷的部分，因而在樣品四周有染液沉積的地方，散射電于的能力強，表現為暗區，而在有樣品的地方散射電子的能力弱，表現為亮區。這樣便能把樣品的外形與表面結構清楚地襯托出來。 負染色法由于操作簡單，目前在進行透射電鏡生物樣品制片時比較常用。本實驗將主要介紹采用滴液法結合負染色技術觀察細菌及核酸分子的形態。

1.  細菌的電鏡樣品制備

（1）將適量無菌水加人生長良好的細菌斜面內，用吸管輕輕撥動菌體制成菌懸掛液，.用無菌濾紙過濾，并調整濾液中的細胞濃度為108?109個/毫升。

（2）取等量的上述菌懸液與等量的2%的磷鎢酸鈉水溶液混合，制成混合菌懸液。

（3）用無菌毛細吸管吸取混合菌懸液滴在銅網膜上。

（4）經3~5 min后，用濾紙吸去余水，待樣品干燥后，置低倍光學顯微鏡下檢查，挑選膜完整、菌體分布均勻的銅網，有時為了保持菌體的原有形狀，常用戊二醛、甲醛、鋨酸蒸氣等試劑小心固定后再進行染色。其方法是將用無菌水制備好的菌懸液經過濾，然后向濾液中加幾滴固定液（如pH7.2，0.15%的戊二醛磷酸緩沖液），經這樣預先稍加固定后，離心，收集菌體，制成菌懸液，再加幾滴新鮮的戊二 醛，在室溫或冰箱內固定過夜。次日離心，收集菌體，再用無菌水制成菌懸液，并調整細胞濃度為108?109個/毫升。然后按上述方法染色。

2.  核酸分子的電鏡樣品制備

圖2  用電鏡檢測質粒DNA的方法示意圖

核酸分子鏈一般較長，采用普通的滴液或噴霧法易使其結構受到破壞，因此目前多采用蛋白質單分子膜技術來進行核酸分子樣品的制備。其原理是：很多球狀蛋白均能在水溶液或鹽溶液的表面形成不溶的變性薄膜，在適當的條件下這一薄膜可以成為單分子層，由伸展的肽鏈構成為一個分子網，當核酸分子與該蛋白質單分子膜作用時，會由于蛋白質的氨基酸堿性側鏈基團的作用，使得核酸從三維空間結構的溶液構型吸附于肽鏈網而轉化為二維空間的構型，并從形態到結構均能保持一定程度的完整性。最后將吸附核?酸分子的蛋白質單分子膜轉移到載膜上，用負染等方法增加樣品的反差后置電鏡觀察。可用展開法、擴散法、一步稀釋法等使核酸吸附到蛋白質單分子膜上，本實驗采用展開法。

（1）將質粒pBR322與一堿性球狀蛋白溶液（一般為細胞色素c）混合，使濃度分別達到0.5?2  mg/ml和1 mg/ml，并加人終濃度為0.5?1 mol/L的醋酸銨和1 mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉，成為展開溶液，pH為7.5。

（2）在一干凈的平皿中注人一定下相溶液（蒸餾水或0.1~0.5  mol/L的醋酸銨溶液），并在液面上加人少量滑石粉。將一干凈載玻片斜放于平皿中，用微量注射器或移液槍吸取50 微升的展開溶液，在離下相溶液表面約1 cm左右的載玻片上前后擺動，滴于載玻片的表面，此時可看到滑石粉層后退，說明蛋白質單分子膜逐漸形成，整個過程約需2~3 min。載玻片傾斜的角度決定了展開液下滑至下相溶液的速度，并對單分子膜的形成質量有影響，經驗證明傾斜度以15°左右為宜。在蛋白形成單分子膜時，溶液中的核酸分子也同時分布于蛋白質基膜中間，并略受蛋白質肽鏈的包裹，理論計算及實驗證明，當1 mg的蛋白質展開成良好的單分子膜時，其面積約為1 m2， 因而可根據最后形成的單分子膜面枳的大小估計其好壞程度。如果面積過小，說明形成的膜并非單分子層，因而核酸就有局部或全部被膜包裹的危險，使整個核酸分子消失或反差變壞。

在單分子膜形成時整個裝置最好用玻璃罩等蓋住，以防操作人員的呼吸和旁人走動等引起氣流的影響以及灰塵等臟物的污染。另外，在展開溶液中可適量加入一些與核算量相差不懸殊的指示標本，如煙草花葉病病毒等，以利于鑒定單分子膜的展開劑后面轉移的好壞。

（3）單分子膜形成后，用電鏡鑷子取一覆有支持膜的載網，使支持膜朝下，放置于離單分子膜前沿1 cm或距離載玻片0.5 cm的膜表面上，并用鑷子即刻撈起，單分子膜即吸附于支持膜上。多余的液體可用小片濾紙吸去，也可將載網直接漂浮于無水乙醉中10-30 s。

（4）將載有單分子膜的載網置于10-3-10-5 mol/L的醋酸鈾乙醇溶液中染色約30 s（此步可在用乙醇脫水時同時進行）或用旋轉投影的方法將金屬噴鍍于核酸樣品的表面。也可將二種方法結合起來，在染色后再進行投影，其效果有時比單獨使用一種方法更好一些。

五、觀察

將載有樣品的銅網置于透射電鏡中進行觀察。