實驗概要
本實驗通過電轉化連接物，構建了抗體文庫。
主要試劑
1. SOC培養基(將20g細菌培養用胰蛋白胨、5g酵母提取物及0.5g NaCl溶于950ml水中。加入10m1 250mmol/L KCl，5mol/L NaOH調整pH至7.0并加入去離子水至IL。高壓滅菌。手感變涼后，再加入5ml 2mol/L MgCl2和20ml lmol/L葡萄糖)
2. 100mm和150mm含100ug/m1氨芐青霉素和2%葡萄糖的TYE平板(TYE/amp/glu)(將16g細菌培養用胰蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl和15g細菌培養用瓊脂加入到去離子水中并調整體積至1L。高壓滅菌。當溶液手感變涼時，加入氨芐青霉素和葡萄糖并倒板)
3. 含100ug/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的2×TY培養基(2×TY/amp/glu)
4. 50%甘油
主要設備
1. 37℃孵育箱(NewBrunswick)
2. 電轉化儀及0.2cm間距小杯(GenePulserTM Biorad)
3. 16℃水浴儀器
實驗材料
電感受態大腸桿菌TG1
實驗步驟
1．將電轉化儀設置為200D(電阻)、25rtF(電容)和2.5kV。
2．在冰上復溶電感受態細菌或使用新鮮制備的電感受態細胞。將電轉化杯、杯固定夾、細胞和DNA均放于冰上。
3．將80ng已純化且無鹽的DNA與50g1細菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。
4．將混合物轉移至0.2cm間距的電轉化杯中，小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯，使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉移以使小杯處于低溫狀態。
5．將透明杯放入電轉化儀內，確保小杯側面干燥(以免電弧)。啟動脈沖，立即加入1.0ml SOC培養基并混合。時間恒定值應在4.5～5.5毫秒范圍之間。如果時間恒定值小于4.3秒，則重復DNA沉淀。
6．在每次電轉化后的細菌中加入lmlSOC培養基，以250r/min振蕩培養，37℃1小時。
7．合并所有電轉化培養液，系列稀釋后在100mm TYE/amp/glu平板上鋪板確定文庫容量。
8．以200g、4℃10分鐘離心剩余的細菌培養液。將每4次電轉化的沉淀重懸于500u1的體積。以每份125ul等量體積分別鋪于150mmTYE/amp/glu平板上或將500ul鋪于含TYE/amp/glu的Nunclon quare ishes500cm2。將這些平板在30℃下培養過夜。
9．加入10m1含15%甘油(0.2gm濾膜過濾除菌)的TYE/amp/glu培養基；刮取平板上的細菌。在-70℃下儲存抗體文庫。
